Modelando el pirenoide

Jul 12, 2023

Nature Plants volumen 8, páginas 583–595 (2022)Citar este artículo

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Detalles de métricas

Muchos organismos fotosintéticos eucariotas mejoran su absorción de carbono suministrando CO2 concentrado a la enzima fijadora de CO2 Rubisco en un orgánulo llamado pirenoide. Los esfuerzos en curso buscan diseñar este mecanismo de concentración de CO2 basado en pirenoides (PCCM) en los cultivos para aumentar los rendimientos. Aquí desarrollamos un modelo computacional para un PCCM sobre la base del mecanismo postulado en el alga verde Chlamydomonas reinhardtii. Nuestro modelo recapitula todos los fenotipos mutantes deficientes en PCCM de Chlamydomonas y produce principios biofísicos generales que subyacen al PCCM. Mostramos que un PCCM eficaz y energéticamente eficiente requiere una barrera física para reducir la fuga de CO2 pirenoide, así como la localización adecuada de enzimas para reducir el ciclo inútil entre CO2 y HCO3-. Es importante destacar que nuestro modelo demuestra la viabilidad de una estrategia de absorción de CO2 puramente pasiva a nivel de CO2 en el aire, mientras que la absorción activa de HCO3− resulta ventajosa a niveles más bajos de CO2. Proponemos un camino de ingeniería de cuatro pasos para aumentar la tasa de fijación de CO2 en el cloroplasto de la planta hasta tres veces a un costo teórico de solo 1.3 ATP por CO2 fijado, ofreciendo así un marco para guiar la ingeniería de un PCCM en plantas terrestres.

La enzima fijadora de CO2 Rubisco media la entrada de aproximadamente 1014 kilogramos de carbono en la biosfera cada año1,2,3. Sin embargo, en muchas plantas, Rubisco fija el CO2 a menos de un tercio de su tasa máxima bajo los niveles atmosféricos de CO2 (Figura complementaria 1)4,5,6, lo que limita el crecimiento de cultivos como el arroz y el trigo7. Para superar esta limitación, muchos organismos fotosintéticos, incluidas las plantas C48,9, las plantas de metabolismo del ácido de las crasuláceas (CAM)10, las algas11,12 y las cianobacterias13, mejoran la tasa de fijación de CO2 de Rubisco al suministrarle CO214,15 concentrado. En las algas, este mecanismo de concentración de CO2 ocurre dentro de un orgánulo de fases separadas llamado pirenoide16,17,18,19. Los mecanismos de concentración de CO2 basados ​​en pirenoides (PCCM) median aproximadamente un tercio de la fijación global de CO216.

Si bien trabajos anteriores han identificado componentes moleculares esenciales para el PCCM16,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, los principios operativos clave de este mecanismo siguen sin comprenderse bien debido a la falta de análisis cuantitativo y sistemático. . Al mismo tiempo, existe un interés creciente en diseñar un PCCM en cultivos C3 para mejorar los rendimientos y la eficiencia en el uso del agua y el nitrógeno30,31. Las preguntas clave son: (1) ¿Cuál es el conjunto mínimo de componentes necesarios para lograr un PCCM funcional? (2) ¿Cuál es el costo energético de operar un PCCM mínimo?

Para avanzar en nuestra comprensión de la PCCM, desarrollamos un modelo de reacción-difusión sobre la base del mecanismo postulado en el alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas en adelante; Fig. 1a)31,32,33: Brevemente, carbono inorgánico externo (Ci: CO2 y HCO3-) es transportado a través de la membrana plasmática por los transportadores LCI1 (Cre03.g162800) y HLA3 (Cre02.g097800)23,24,34. El Ci citosólico se concentra en el estroma del cloroplasto en forma de HCO3−, ya sea a través de la conversión de CO2 en HCO3− por el supuesto complejo de anhidrasa carbónica estromal LCIB/LCIC (Cre10.g452800/Cre06.g307500) (LCIB en adelante)22,35, 36 o a través del transporte directo a través de la membrana del cloroplasto por el transportador de HCO3− mal caracterizado LCIA (Cre06.g309000)24,37. Actualmente no se sabe si LCIA es un canal pasivo o una bomba; por lo tanto, en el modelo lo consideramos primero como un canal pasivo (indicado por LCIAC) y luego como una bomba activa (indicado por LCIAP). Una vez en el estroma, el HCO3− viaja a través de los canales putativos de HCO3− BST1–3 (Cre16.g662600, Cre16.g663400 y Cre16.g663450)25 hacia la luz del tilacoides y se difunde a través de los túbulos de la membrana hacia el pirenoide donde la anhidrasa carbónica CAH3 ( Cre09.g415700)38,39,40 convierte HCO3− en CO2. Este CO2 se difunde desde la luz del túbulo tilacoidal hacia la matriz pirenoide, donde Rubisco cataliza la fijación. La Tabla complementaria 1 resume los acrónimos de las proteínas clave en Chlamydomonas PCCM.

a, Caricatura de un cloroplasto de Chlamydomonas con componentes PCCM conocidos. El HCO3− es transportado a través de la membrana del cloroplasto por LCIA y a través de las membranas de los tilacoides por BST1–3 (de ahora en adelante denominado BST por simplicidad). En la luz ácida de los tilacoides, una anhidrasa carbónica CAH3 convierte el HCO3− en CO2, que se difunde hacia la matriz pirenoide donde se localiza la enzima fijadora de CO2 Rubisco (Rbc). La fuga de CO2 fuera de la matriz y el cloroplasto puede verse impedida por posibles barreras de difusión (una vaina de almidón y pilas de tilacoides) y por la conversión a HCO3− por un complejo de recaptura de CO2 LCIB/LCIC (de ahora en adelante denominado LCIB por simplicidad) en el estroma básico del cloroplasto. b, Un esquema del PCCM modelado, que considera la difusión intracompartimental y el intercambio intercompartimental de CO2 y HCO3−, así como su interconversión, como se indica en el recuadro. Código de colores como en a. El modelo es esféricamente simétrico y consta de una matriz pirenoide central rodeada por un estroma. Los tilacoides corren a través de la matriz y el estroma; su volumen y área de superficie corresponden a una red reticulada en el centro de la matriz extendida por cilindros que corren radialmente hacia afuera. c, Perfiles de concentración de CO2 y HCO3- en el tilacoide (curvas discontinuas) y en la matriz/estroma (curvas continuas) para el modelo PCCM de referencia que carece de actividad LCIA y barreras de difusión. La línea gris punteada indica el Rubisco Km efectivo para CO2 (Métodos). Código de colores como en a. d, Flujos netos de carbono inorgánico entre los compartimentos indicados. El ancho de las flechas es proporcional al flujo; el área de los círculos es proporcional a la concentración molecular promedio en las regiones correspondientes. El bucle negro discontinuo denota el principal ciclo fútil del carbono inorgánico en el cloroplasto. Código de colores como en a. Para c y d, la permeabilidad de la membrana del cloroplasto mediada por LCIAC al HCO3− \(\kappa _{{{{\mathrm{cloro}}}}}^{H^ - }\) = 10−8 m s−1, BST- permeabilidad de la membrana tilacoidal mediada al HCO3− \(\kappa_{{{{\mathrm{thy}}}}}^{H^ - }\) = 10−2 m s−1, tasa LCIB VLCIB = 103 s−1 y Tasa de CAH3 VCAH3 = 104 s−1 (Métodos). Otros parámetros del modelo se estiman a partir de experimentos (Tabla complementaria 2).

Modelamos las actividades enzimáticas anteriores y el transporte de Ci en un cloroplasto esférico. Suponemos que las anhidrasas carbónicas catalizan la interconversión bidireccional de CO2 y HCO3−, produciendo un flujo neto en una dirección donde las dos especies están fuera de equilibrio. Consideramos tres compartimentos de cloroplastos a valores de pH constantes: una matriz pirenoide esférica (pH 8, ref. 41) en el centro, un estroma circundante (pH 8, ref. 41,42) y tilacoides (pH luminal 6, ref. 43 ) atravesando tanto la matriz como el estroma (Fig. 1b y Fig. 2 complementaria). El equilibrio de flujo de la reacción y difusión intracompartimental y el intercambio intercompartimental establece los perfiles de concentración en estado estacionario de las especies de Ci en todos los compartimentos (Métodos). Para tener en cuenta el efecto del transporte de Ci a través de la membrana celular, simulamos una amplia gama de piscinas de Ci citosólicas circundantes desde las cuales el cloroplasto puede absorber Ci. Caracterizamos el rendimiento del PCCM modelado con dos métricas: (1) su eficacia, cuantificada por el flujo de fijación de CO2 calculado normalizado por el flujo máximo posible a través de Rubisco; y (2) su eficiencia, cuantificada por el costo de ATP por CO2 fijado (Métodos).

Para identificar los componentes mínimos de un PCCM funcional, construimos un modelo de referencia (Fig. 1c, d), con la anhidrasa carbónica LCIB difusa en todo el estroma, los canales BST para HCO3− distribuidos uniformemente en las membranas tilacoides, la anhidrasa carbónica CAH3 localizada a la luz tilacoide dentro del pirenoide, y Rubisco condensado dentro de la matriz pirenoide. Este modelo carece del transportador de HCO3− LCIA y de posibles barreras de difusión para Ci. Primero analizamos el rendimiento de PCCM modelado bajo CO2 a nivel de aire (10 μM citosólico); las condiciones más bajas de CO2 se analizan en secciones posteriores.

El CO2 que se difunde en el cloroplasto se convierte en HCO3− en el estroma de pH alto donde la proporción de equilibrio CO2:HCO3− es 1:80 (Métodos). Dado que la difusión pasiva de HCO3− a través de la envoltura del cloroplasto es muy lenta, este HCO3− concentrado queda atrapado en el estroma. Los canales BST equilibran el HCO3- a través de la membrana tilacoidal, por lo que el HCO3- también alcanza una alta concentración en la luz del tilacoides (Fig. 1c). El pH bajo en la luz de los tilacoides favorece una partición de equilibrio aproximadamente igual entre CO2 y HCO3−; sin embargo, el HCO3− no se equilibra con el CO2 inmediatamente después de ingresar al tilacoide fuera del pirenoide, ya que allí no hay anhidrasa carbónica (CA). En cambio, el HCO3− se difunde dentro de la luz del tilacoides hacia el pirenoide, donde el CAH3 localizado dentro del radio del pirenoide convierte rápidamente el HCO3− nuevamente en CO2 (Fig. 1d). Este CO2 puede difundirse a través de la membrana tilacoide hacia la matriz pirenoide. Este modelo de referencia, impulsado únicamente por las diferencias de pH intercompartimentales, logra una concentración de CO2 pirenoidal de aproximadamente 2,5 veces la que se encuentra en un modelo sin PCCM.

La fuga sustancial de CO2 fuera de la matriz en el modelo de referencia (Fig. 1d) se debe en parte a la cinética relativamente lenta de Rubisco. Durante el tiempo promedio requerido para que Rubisco fije una molécula de CO2 en el pirenoide, esa molécula de CO2 generalmente puede difundir una distancia mayor que el radio del pirenoide (Nota complementaria I). Por lo tanto, la mayoría de las moléculas de CO2 que ingresan a la matriz pirenoide saldrán sin ser fijadas por Rubisco (Fig. 3 complementaria). Se podría pensar que agregar LCIAC como un canal pasivo para mejorar la difusión de HCO3− en el cloroplasto podría superar este déficit (Fig. 2a). Sin embargo, incluso con la adición de LCIAC a nuestro modelo de PCCM de referencia, ninguna combinación de actividades enzimáticas y tasas de transporte del canal logra un PCCM efectivo, es decir, más de la mitad de la saturación de Rubisco con CO2 (Fig. 2b y Fig. 4 complementaria) . Por lo tanto, el PCCM controlado por pH no puede funcionar de manera eficaz sin una barrera de difusión.

a–i, Un modelo sin barrera para la difusión de CO2 fuera de la matriz pirenoide (a–c) se compara con un modelo con pilas de tilacoides que ralentizan la difusión de carbono inorgánico en el estroma (d–f) y un modelo con una cubierta impermeable de almidón (g–i) bajo CO2 a nivel del aire (10 µM citosólico). a, d, g, Esquemas del cloroplasto modelado. b, e, h, Mapas de calor del flujo de fijación de CO2 normalizado, definido como la relación entre el flujo de carboxilación de Rubisco total y su máximo si Rubisco estuviera saturado, con permeabilidades de membrana de cloroplasto mediadas por LCIAC variables a HCO3− y tasas de LCIB variables. La permeabilidad de la membrana tilacoide mediada por BST al HCO3− es la misma que en la Fig. 1c, d. Para eyh, las curvas negras discontinuas indican un flujo de fijación de CO2 normalizado de 0,5. c,f,i, Flujos generales de HCO3- (izquierda) y CO2 (centro) en el cloroplasto, normalizados por el flujo máximo de fijación de CO2 si Rubisco estuviera saturado, con permeabilidades de membrana de cloroplasto mediadas por LCIAC variables a HCO3- y tasas LCIB variables . Los valores negativos denotan salida del cloroplasto. La especie de carbono inorgánico (Ci) con un influjo positivo se define como la fuente de Ci (derecha). Los ejes son los mismos que en b, e y h.

Para operar un PCCM más efectivo, la celda debe reducir la fuga de CO2 de la matriz pirenoide. Una barrera a la difusión de CO2 se ha considerado esencial para varios mecanismos de concentración de CO244,45,46,47. Aunque la matriz está densamente empaquetada con Rubisco, nuestro análisis sugiere que la difusión lenta de CO2 en la matriz pirenoide debido al volumen ocupado por Rubisco solo puede explicar una disminución del 10% en la fuga de CO2 (Nota complementaria VI.C). Por lo tanto, consideramos barreras alternativas en nuestro modelo.

Especulamos que las láminas de membrana tilacoides y la vaina de almidón pirenoide podrían servir como barreras efectivas para disminuir la fuga de CO2 de la matriz. Las láminas de membrana tilacoides podrían servir como barreras efectivas para la difusión de CO2 porque las moléculas en el estroma deben difundir entre y a través de las membranas interdigitadas45. De hecho, nuestras simulaciones de primer principio sugieren que las pilas de tilacoides, modeladas con geometría realista48, reducen efectivamente la difusión de Ci en el estroma (Fig. 5 complementaria). La evidencia sobre el papel de la vaina de almidón en el PCCM es limitada y mixta. Si bien los primeros trabajos sugirieron que un mutante de Chlamydomonas sin almidón tenía un rendimiento PCCM normal en el aire49, el fenotipo no se comparó con la cepa parental apropiada. Un estudio más reciente encontró que un mutante (sta2-1) con una cubierta de almidón más delgada que las cepas de tipo salvaje muestra una menor eficacia de PCCM a muy bajo CO250. Sobre la base de este último trabajo, planteamos la hipótesis de que la vaina de almidón que rodea la matriz puede actuar como una barrera para la difusión de CO2. Dado que la vaina de almidón consta de muchas láminas de amilopectina cristalina51,52,53, la modelamos como una barrera esencialmente impermeable equivalente a 10 bicapas lipídicas; en su presencia, la mayor parte de la fuga de CO2 fuera de la matriz se produce a través de los túbulos tilacoides (Fig. 6 complementaria).

A continuación, probamos si las dos barreras de difusión realistas anteriores permiten una PCCM efectiva impulsada por el pH. Agregar pilas de tilacoides o una vaina de almidón al modelo PCCM de referencia anterior reduce drásticamente la fuga de CO2 de la matriz al estroma (Fig. 7 complementaria). El PCCM resultante es altamente efectivo en condiciones de CO2 a nivel de aire (10 μM citosólico): las concentraciones de CO2 pirenoidal se elevan por encima de la constante de media saturación efectiva Km de Rubisco (Métodos) usando solo el diferencial de pH intercompartimental y la absorción pasiva de Ci (Fig. 2e ,h). El rendimiento de PCCM con ambas barreras presentes se asemeja mucho al caso de la cubierta impermeable de almidón (Figura complementaria 8); por simplicidad, omitimos un modelo combinado de este tipo de una discusión adicional.

Además del requisito de una barrera de difusión, la eficacia de la PCCM impulsada por el pH depende de la tasa de LCIB y de la permeabilidad de la membrana del cloroplasto mediada por LCIAC al HCO3- (Fig. 2b, e, h). Dependiendo de la actividad de LCIB, nuestro modelo sugiere dos estrategias distintas para captar pasivamente Ci. Si la actividad de LCIB es baja, el flujo de fijación de CO2 aumenta con una mayor permeabilidad mediada por LCIAC a HCO3-, lo que facilita la difusión de HCO3- citosólico en el estroma (Fig. 2c, f, i). Por el contrario, si la actividad de LCIB es alta, el flujo de fijación de CO2 se maximiza cuando la permeabilidad mediada por LCIAC es baja; en este caso, una entrada difusiva de CO2 en el cloroplasto es rápidamente convertida por LCIB en HCO3-, que queda atrapado y concentrado en el cloroplasto. Bajo este escenario, la permeabilidad de la membrana del cloroplasto al HCO3- debido a LCIAC es perjudicial, ya que permite que el HCO3- convertido por LCIB en el estroma se difunda de regreso al citosol (Fig. 2c, f, i).

Curiosamente, el mayor flujo de fijación de CO2 se logra mediante la captación pasiva de CO2 mediada por la actividad de la anhidrasa carbónica de LCIB, no por la captación pasiva de HCO3− a través de los canales LCIAC (fig. 2), aunque el HCO3− es más abundante que el CO2 en el citosol. La consideración clave es que el estroma (a pH 8) es más básico que el citosol (a pH 7,1, ref. 54), lo que permite que LCIB equilibre el CO2 adquirido pasivamente con HCO3− para crear una concentración de HCO3− aún más alta en el estroma que en el citosol.

Mientras que la estrategia de captación pasiva de CO2 puede impulsar el PCCM impulsado por el pH bajo CO2 a nivel de aire (10 μM citosólico), su tasa de captación de Ci está limitada en última instancia por la difusión de CO2 a través de la envoltura del cloroplasto. De hecho, nuestras simulaciones muestran que en condiciones muy bajas de CO2 (1 μM citosólico)55, un cloroplasto que utiliza la estrategia de absorción pasiva de CO2 solo puede alcanzar como máximo el 20 % de su flujo máximo de fijación de CO2, incluso en presencia de barreras a la difusión de Ci ( Fig. 3). Dado que la captación pasiva de HCO3− no puede concentrar más Ci que la captación pasiva de CO2 (Fig. 2), planteamos la hipótesis de que se requiere un transporte activo de Ci para una PCCM eficaz con un CO2 muy bajo. Para probar esta idea, consideramos un modelo que emplea bombas activas LCIA HCO3− (LCIAP) sin actividad LCIB (Fig. 3a, d, g). Encontramos que, de hecho, el bombeo de HCO3− permite saturar el flujo de fijación de CO2 en condiciones muy bajas de CO2 (Fig. 3 y Fig. 12 complementaria).

a–i, se muestran los resultados de un modelo sin barrera para la difusión de CO2 fuera de la matriz pirenoide (a–c), un modelo con pilas de tilacoides que sirven como barreras de difusión (d–f) y un modelo con una cubierta impermeable de almidón ( soldado americano). a, d, g, Esquemas del cloroplasto modelado que emplea LCIB para la absorción pasiva de CO2 (rojo), o que emplea el bombeo activo de HCO3- mediado por LCIAP a través de la envoltura del cloroplasto y sin actividad LCIB (azul). Se muestra el rendimiento de PCCM con CO2 a nivel de aire (citosólico 10 µM) (b,e,h) y con CO2 muy bajo (citosólico 1 µM) (c,f,i), medido por el flujo de fijación de CO2 normalizado frente al ATP gastado por CO2 fijo, para las dos estrategias de absorción de carbono inorgánico en a, d y g. Las curvas sólidas indican el costo mínimo de energía necesario para lograr un cierto flujo de fijación de CO2 normalizado. Las regiones sombreadas representan el rango de posibles desempeños encontrados al variar las tasas de transporte de HCO3− y las tasas de LCIB. Código de colores como en a. En h e i, las curvas negras discontinuas indican el rendimiento óptimo de PCCM de un modelo simplificado que supone una difusión intracompartimental rápida, una difusión rápida de HCO3− a través de las membranas tilacoides y un equilibrio rápido entre CO2 y HCO3− catalizado por CAH3 en los túbulos tilacoides dentro del pirenoide (Métodos).

De acuerdo con nuestro modelo, tanto la captación pasiva de CO2 como el bombeo activo de HCO3− pueden respaldar una PCCM efectiva con CO2 a nivel del aire. Sin embargo, este último consume energía directamente para lograr un transporte no reversible. ¿Cuál es el costo total de energía de un PCCM que emplea la absorción activa de HCO3− y cómo se compara este costo con el de la estrategia de absorción pasiva de CO2? Para responder a estas preguntas, utilizamos un marco de termodinámica de no equilibrio para calcular el costo de energía de diferentes estrategias de absorción de Ci (Nota complementaria II y Fig. 13) 56. Primero, un PCCM sin barreras de difusión es energéticamente costoso, independientemente de las estrategias de captación de Ci empleadas (Fig. 3a-c). En segundo lugar, en presencia de barreras de difusión, encontramos que la estrategia de absorción pasiva de CO2 puede lograr una eficiencia energética similar (~ 1 costo de ATP por CO2 fijado) a la estrategia activa de absorción de HCO3− (Fig. 3d-i). Por lo tanto, ambas estrategias pueden lograr un alto rendimiento de PCCM a nivel de CO2 en el aire; sin embargo, la captación activa de HCO3− es necesaria para lograr una alta eficacia en condiciones de CO2 más bajas.

¿Cómo afecta el transporte de Ci a través de la membrana plasmática de la célula a las estrategias viables de captación de Ci a nivel del cloroplasto? Para explorar esta pregunta en nuestro modelo a escala de cloroplasto, evaluamos el rendimiento de PCCM en una amplia gama de concentraciones citosólicas de CO2 y HCO3− (Fig. 15 complementaria). Como era de esperar, encontramos que el rendimiento de una estrategia particular de captación de Ci de cloroplastos aumenta con el nivel citosólico de su especie de Ci objetivo. Por lo tanto, es importante reponer las especies Ci citosólicas absorbidas por el cloroplasto. Además, independientemente de la composición del grupo de Ci citosólico, un cloroplasto que carece tanto de captación pasiva de CO2 como de HCO3− no logra una alta eficacia de PCCM, a menos que la concentración citosólica de CO2 sea de 100 μM o superior. Presumiblemente, la creación de tal grupo daría como resultado una fuga sustancial de CO2 a través de la membrana plasmática y, por lo tanto, un alto costo de energía. Por lo tanto, los mecanismos efectivos para la absorción de Ci desde el entorno externo al citosol y desde el citosol al cloroplasto son esenciales para un alto rendimiento de PCCM.

Hasta ahora, solo hemos considerado los patrones de localización de la anhidrasa carbónica que se cree que existen en Chlamydomonas bajo el nivel del aire CO240,57. Para evaluar los beneficios de dicha localización, variamos la localización de CAH3 y LCIB mientras mantenemos el número total de moléculas de cada anhidrasa carbónica (Fig. 4a). Encontramos que la localización de anhidrasa carbónica ectópica compromete el rendimiento de PCCM. Primero, el LCIB mal localizado en la matriz pirenoide básica (pH 8) convierte el CO2 del sustrato de Rubisco en HCO3− y, por lo tanto, disminuye la fijación de CO2 (Fig. 4b-f, región i). En segundo lugar, cuando CAH3 se distribuye en los tilacoides fuera del pirenoide, las moléculas de CO2 producidas por este CAH3 pueden difundirse directamente en el estroma, lo que hace que sea menos probable que se concentren en el pirenoide y, por lo tanto, disminuya la eficacia del PCCM (Fig. 4b-f). , región ii, y Fig. 16 complementaria). Además, la mala localización de CAH3 fuera del pirenoide disminuye la eficiencia de PCCM, ya que conduce a un aumento del ciclo inútil de Ci entre el estroma y el tilacoides, lo que aumenta el costo energético requerido para mantener las diferencias de pH intercompartimentales. Finalmente, la concentración de CAH3 en una pequeña región de la luz del tilacoides en el centro del pirenoide aumenta la distancia sobre la cual el HCO3- necesita difundirse antes de convertirse en CO2, lo que reduce el flujo de producción de CO2 en CAH3 (Fig. 4b-f, región iii). Todos estos resultados son válidos tanto para CO2 a nivel del aire empleando la absorción pasiva de CO2 (Fig. 4) como para niveles muy bajos de CO2 empleando la absorción activa de HCO3− (Figura complementaria 17). Por lo tanto, nuestro modelo muestra que la localización adecuada de la anhidrasa carbónica es crucial para el rendimiento general de la PCCM.

a, Esquemas de localización variable de anhidrasas carbónicas. El dominio CAH3 comienza en el centro de los túbulos intrapirenoides (radio r = 0) y el dominio LCIB termina en la envoltura del cloroplasto. Código de color como en la Fig. 1d. Naranja denota región ocupada por CAH3. b–e, el radio final de CAH3 y el radio inicial de LCIB varían en un cloroplasto modelado que emplea la estrategia de absorción pasiva de CO2 bajo CO2 a nivel del aire, con pilas de tilacoides que ralentizan la difusión de carbono inorgánico en el estroma (b,c) o con una cubierta impermeable de almidón (Delaware). Flujo de fijación de CO2 normalizado (b,d) y ATP gastado por CO2 fijado (c,e) cuando se varían las localizaciones de las anhidrasas carbónicas. f, Esquemas de flujos de carbono inorgánico para los patrones de localización (i–iii) indicados en b–e. Código de color como en a y Fig. 1d. Las marcas punteadas en b-e denotan el radio pirenoide como en a. Los parámetros de simulación son los mismos que en la Fig. 1c, d.

Cuando se cambia de niveles de aire a niveles muy bajos de CO2 (~1 μM disuelto), Chlamydomonas relocaliza LCIB de difuso en todo el estroma a localizado alrededor de la periferia pirenoide57. Para comprender mejor el valor de la localización de LCIB en la periferia pirenoide con niveles muy bajos de CO2, variamos tanto el radio final de LCIB estromal, que define cuánto se extiende LCIB hacia la envoltura del cloroplasto, como el número total de moléculas de LCIB en un modelo que emplea un barrera de la vaina de almidón y absorción activa de HCO3− (Fig. 5a). Nuestro análisis muestra que es un desperdicio energético permitir que el CO2 concentrado se escape del cloroplasto (Fig. 13 complementaria). En consecuencia, el LCIB reubicado cerca de la cubierta de almidón aumenta la eficiencia energética al recuperar las moléculas de CO2 que se difunden fuera de la matriz y atraparlas como HCO3- en el cloroplasto (Fig. 5b-c, región i). El costo de la energía es más alto sin ningún LCIB para la recaptura de CO2 (Fig. 5b-c, región iii), o con LCIB estromal difuso, que permite que el HCO3− entrante se convierta en CO2 cerca de la membrana del cloroplasto, momento en el cual puede filtrarse de regreso a el citosol (Fig. 5b-c, región ii y Fig. 19 complementaria). Por lo tanto, nuestro modelo sugiere que, en condiciones de CO2 muy bajo y en presencia de una fuerte barrera de difusión de CO2 alrededor del pirenoide, la localización de LCIB en la periferia del pirenoide permite un reciclaje eficiente de Ci, lo que mejora el rendimiento de PCCM.

a, Esquemas de la actividad variable y el radio final de LCIB en un cloroplasto modelado que emplea una vaina de almidón impermeable y HCO3− activo que bombea a través de la envoltura del cloroplasto con muy poco CO2. Código de color como en la Fig. 4a. El dominio LCIB comienza en el radio pirenoide (0,3 en el eje x en b y c). b,c, flujo de fijación de CO2 normalizado (b) y ATP gastado por CO2 fijado (c) cuando se varían las características designadas de LCIB. d, Esquemas de flujos de carbono inorgánico para los estados LCIB (i–iii) indicados en b y c. Código de color como en la Fig. 4f. Parámetros de simulación como en la Fig. 4. El bombeo de HCO3− mediado por LCIAP activo se describe mediante la tasa \(\kappa_{{{{\mathrm{cloro}}}}}^{H^ - }\) = 10−4 m s−1 y la reversibilidad γ = 10−4. Para mostrar una variación notable en el flujo de fijación de CO2 normalizado, se simula un modelo con túbulos tilacoides acortados (Métodos). Los resultados cualitativos son válidos independientemente de esta elección específica.

Para determinar el impacto de la luz de los tilacoides y el pH del estroma en la función PCCM, variamos los valores de pH de los dos compartimentos (Fig. 6 y Fig. 20 complementaria). Encontramos que, independientemente de la estrategia de captación de Ci, el PCCM modelado logra una alta eficacia solo cuando la luz de los tilacoides es mucho más ácida que el estroma (Fig. 6a, d). De hecho, la actividad de la anhidrasa carbónica en un estroma de pH bajo (Fig. 6, región i) o en un lumen de túbulo intrapirenoide de pH alto (Fig. 6, región ii) conduciría a bajas concentraciones de HCO3- o CO2, respectivamente, en esos compartimentos; ambos serían perjudiciales para la PCCM. Curiosamente, la variación en el pH influye diferencialmente en la eficiencia energética del PCCM que emplea la absorción pasiva de CO2 (Fig. 6a-c) y el PCCM que emplea el bombeo activo de HCO3− (Fig. 6d-f). Específicamente, solo el último muestra un costo de energía dramáticamente aumentado cuando el estroma tiene un pH relativamente bajo; en este caso, la mayor parte del HCO3− bombeado al estroma se convierte en CO2 y posteriormente se pierde en el citosol (Fig. 6e, f, regiones i y ii). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que el alto rendimiento de PCCM requiere el mantenimiento de un estroma de pH alto y un lumen de tilacoides de pH bajo.

a–f, los valores de pH de la luz de los tilacoides y el estroma se varían en un cloroplasto modelado con una vaina de almidón impermeable que emplea la captación pasiva de CO2 bajo el nivel de aire de CO2 (a–c) (10 μM citosólico; parámetros como en la Fig. 4d, e) o bombeo activo de HCO3− bajo CO2 muy bajo (d – f) (1 μM citosólico, parámetros como en la Fig. 17c, d complementaria). Se muestra el flujo de fijación de CO2 normalizado (a, d) y el ATP gastado por CO2 fijado (b, e) como funciones de los valores de pH en los dos compartimentos. c,f, Esquemas de depósitos y flujos de carbono inorgánico para los valores de pH indicados en a, b, d y e. Las estrellas blancas indican los valores de pH de referencia utilizados en todas las demás simulaciones.

A continuación, exploramos si nuestro modelo puede explicar los fenotipos de mutantes deficientes en PCCM de Chlamydomonas conocidos. Seleccionamos los parámetros del modelo para representar mejor el efecto de cada mutación, asumiendo que el PCCM de Chlamydomonas cambia de la absorción pasiva de CO2 bajo CO2 a nivel del aire a la absorción activa de HCO3- bajo CO2 muy bajo (Figs. 23 y 24 complementarias). Nuestros resultados de simulación muestran un acuerdo semicuantitativo con los resultados experimentales para todos los mutantes publicados (Tabla complementaria 5) y brindan explicaciones mecánicas para todos los fenotipos registrados. Por ejemplo, nuestro modelo capta que el mutante lcib no crece en el aire, presumiblemente debido a un defecto en la absorción pasiva de CO2. Este fenotipo implica que Chlamydomonas no bombea HCO3− al cloroplasto bajo CO2 al nivel del aire porque un mutante lcib modelado que emplea el bombeo de HCO3− tiene un PCCM lo suficientemente efectivo como para impulsar el crecimiento en el aire. En particular, el mutante lcib recupera el crecimiento en condiciones muy bajas de CO2, lo que atribuimos a la activación de un sistema de captación de HCO3− en estas condiciones22,57,58. De hecho, la eliminación del gen que codifica los transportadores LCIA HCO3- en el fondo mutante lcib da como resultado una disminución drástica en la fijación de CO2 y el crecimiento en condiciones muy bajas de CO257.

En términos más generales, nuestro modelo recapitula los fenotipos de mutantes de Chlamydomonas que carecen del transportador de HCO3− HLA3 o del transportador de CO2 LCI1 en la membrana plasmática. De hecho, la eliminación del gen que codifica HLA3 (simulado como un nivel más bajo de HCO3− citosólico) conduce a una disminución drástica de la eficacia de PCCM en condiciones de CO2 muy bajas, presumiblemente debido a la reducción de la importación de HCO3− a la célula y, por lo tanto, al cloroplasto23,24. Por el contrario, el mutante único lci1 muestra una disminución moderada en la eficacia de PCCM bajo niveles de CO2 en el aire, presumiblemente debido a una entrada reducida de CO2 en el citosol y, por lo tanto, en el cloroplasto, pero ningún efecto sobre el PCCM bajo CO2 muy bajo, presumiblemente debido a la activación de un sistema activo de captación de HCO3− bajo esta condición34.

Finalmente, nuestro modelo captura los fenotipos de los mutantes de almidón de Chlamydomonas, que sobreviven tanto en condiciones de nivel de aire como de CO2 muy bajo, presumiblemente porque las pilas de tilacoides pueden bloquear eficazmente la fuga de CO2 del pirenoide en ausencia de una vaina de almidón. La existencia de barreras de difusión sin almidón, como las pilas de tilacoides, también puede ayudar a explicar por qué algunas otras algas que contienen pirenoides no tienen una cubierta de almidón59.

El análisis de los flujos de Ci en nuestro modelo respalda la opinión de larga data de que los túbulos tilacoides que atraviesan el pirenoide en Chlamydomonas pueden entregar HCO3− estromal al pirenoide, donde puede convertirse en CO2 por CAH332,60. Sin embargo, ¿es necesaria una arquitectura tilacoidal similar a Chlamydomonas para un PCCM funcional? Ciertamente, las algas eucariotas muestran una variedad de morfologías de tilacoides, como múltiples pilas de tilacoides paralelas no conectadas que pasan a través del pirenoide, un solo disco de tilacoides que divide en dos la matriz del pirenoide, o láminas de tilacoides que rodean pero no atraviesan el pirenoide61,62,63,64 . Nuestros cálculos muestran que las diferentes morfologías de los tilacoides podrían, en principio, respaldar el funcionamiento de un PCCM eficaz, siempre que el HCO3− pueda difundirse en la luz de los tilacoides de pH bajo y la anhidrasa carbónica de los tilacoides se localice en la luz proximal del pirenoide (Fig. 25 complementaria). ).

Nuestro modelo identifica una configuración PCCM mínima suficiente para concentrar CO2 de manera efectiva. A continuación, nos preguntamos: ¿configuraciones alternativas de los mismos elementos mínimos pueden lograr un PCCM efectivo? Restringimos nuestro enfoque a los PCCM que emplean estrategias pasivas de absorción de Ci. Medimos la eficacia y el costo energético de 216 configuraciones parciales de PCCM en el aire, variando la presencia y localización de Rubisco, tilacoides y anhidrasas carbónicas del estroma, canales de HCO3− en las membranas de los tilacoides y la envoltura del cloroplasto, y barreras de difusión (Fig. 26 complementaria) .

Nuestros resultados resumen tres módulos centrales de una PCCM efectiva impulsada por el pH (Fig. 7a): (i) una anhidrasa carbónica estromal (LCIB) para convertir el CO2 adquirido pasivamente en HCO3−, (ii) un canal HCO3− de membrana tilacoidal (BST) y una anhidrasa carbónica luminal (CAH3) que juntas permiten la conversión de HCO3− a CO2 cerca de Rubisco, y (iii) un condensado de Rubisco rodeado por barreras de difusión. Encontramos que las configuraciones de PCCM que carecen de cualquiera de estos módulos muestran una capacidad comprometida para concentrar CO2 (Fig. 7b). La configuración PCCM similar a Chlamydomonas es la única configuración que posee los tres módulos; por lo tanto, esta configuración no solo es suficiente sino también necesaria para lograr un PCCM efectivo utilizando los elementos mínimos considerados.

a, Esquemas de los tres módulos esenciales con funciones designadas (mismo estilo que en la Fig. 1a). En Chlamydomonas, LCIB puede usarse para la captación pasiva de CO2, que luego queda atrapado en el estroma como HCO3− (módulo i); BST permite que el HCO3− del estroma se difunda hacia la luz de los tilacoides, donde CAH3 convierte el HCO3− en CO2 (módulo ii); y una vaina de almidón y pilas de tilacoides podrían actuar como barreras de difusión para retardar el escape de CO2 fuera de la matriz pirenoide (módulo iii). b, Histogramas de flujo de fijación de CO2 normalizado para configuraciones de CCM sin (izquierda, gris) o con (derecha, coloreado) el módulo respectivo. Probamos 216 configuraciones de CCM variando la presencia y/o localización de enzimas, canales de HCO3− y barreras de difusión en el modelo (ver la Fig. 26 complementaria).

Se cree que muchas plantas terrestres, incluida la mayoría de las plantas de cultivo, carecen de cualquier forma de CCM. Nuestro análisis muestra que una configuración típica de cloroplastos de plantas solo puede soportar ~30% del flujo máximo de fijación de CO2 a través de Rubisco (Tabla complementaria 6). La ingeniería de un PCCM en los cultivos ha surgido como una estrategia prometedora para aumentar los rendimientos a través de una mejor fijación de CO230,31. A pesar de los primeros avances de ingeniería, incluida la expresión de componentes individuales de PCCM65 y la reconstitución de una matriz de pirenoide en plantas66, aún se desconoce el orden óptimo de los pasos de ingeniería necesarios para establecer un PCCM eficaz en el cloroplasto de una planta. Aquí aprovechamos nuestras configuraciones parciales de PCCM para proponer un camino de ingeniería que da como resultado una mejora monotónica de la eficacia y evita costos de energía excesivos.

Hasta donde sabemos, el cloroplasto vegetal contiene anhidrasa carbónica difusa y Rubisco vegetal difuso en el estroma, y ​​carece de canales de HCO3− y barreras de difusión67. Observamos que la planta Rubisco tiene una Km más baja para CO2 que Chlamydomonas Rubisco; nuestros cálculos de ingeniería tienen esto en cuenta y emplean valores de la planta Rubisco. Los estudios también han sugerido que las anhidrasas carbónicas de plantas nativas son difusas en la luz de los tilacoides68, que por lo tanto asumimos en nuestra configuración de cloroplastos de plantas modeladas (Fig. 8, configuración inicial). Esta configuración contiene solo uno de los tres módulos esenciales para un PCCM efectivo (Fig. 7a), es decir, el sistema pasivo de absorción de CO2.

a, Arriba: esquemas de la configuración inicial que representa un cloroplasto vegetal típico que contiene anhidrasa carbónica tilacoide difusa, anhidrasa carbónica estromal difusa y rubisco difusa, y carece de transportadores de HCO3− y barreras de difusión. Abajo: la configuración deseada que representa un cloroplasto de Chlamydomonas que emplea la estrategia de absorción pasiva de CO2 y una cubierta de almidón (como en la Fig. 2g). b, Diagrama de Venn que muestra el flujo de fijación de CO2 normalizado (círculo, área en proporción a la magnitud) y ATP gastado por CO2 fijado (cuadrado, área en proporción a la magnitud) de varias configuraciones después de implementar los cambios designados. Las flechas indican los pasos secuenciales propuestos para transformar la configuración inicial en la configuración deseada (ver texto). La configuración inicial tiene un flujo de fijación de CO2 normalizado de 0,31 y un costo de ATP insignificante. Todos los costes inferiores a 0,25 ATP por CO2 fijado se representan mediante un cuadrado del tamaño mínimo.

Después de explorar todas las rutas paso a paso posibles para instalar los dos módulos restantes para lograr la configuración de PCCM similar a Chlamydomonas (Fig. 8, configuración deseada), sugerimos la siguiente ruta que consta de cuatro pasos de ingeniería mínimos (Fig. 8b, flechas). El primer paso es la localización de la planta Rubisco en una matriz pirenoide, que asumimos que excluiría inherentemente la anhidrasa carbónica estromal de la planta, ya que el apretado empaquetamiento de Rubisco en la matriz parece excluir complejos proteicos superiores a ~80 kDa26,69. El segundo paso es la localización de la anhidrasa carbónica de los tilacoides en los tilacoides que bordean o atraviesan la matriz. Estos dos primeros pasos no producen cambios notables ni en la eficacia ni en la eficiencia del PCCM. El siguiente paso es introducir canales de HCO3− en las membranas de los tilacoides, lo que aumenta el flujo de fijación de CO2 a ~175 % del de la configuración inicial. Este paso también aumenta el costo del PCCM a alrededor de 4 ATP por CO2 fijado. No se puede evitar un paso de tan alto costo, y todos los demás caminos posibles con una eficacia creciente en cada paso tienen configuraciones intermedias más costosas (Fig. 8b y Tabla complementaria 6). Lo que es más importante para la ingeniería, el aumento del flujo de fijación de CO2 resultante de este paso proporcionaría evidencia de que los canales instalados son funcionales. El paso final del camino sugerido es agregar una cubierta de almidón para bloquear la fuga de CO2 de la matriz pirenoide, lo que triplica el flujo de fijación de CO2 en comparación con la configuración inicial y reduce el costo a solo 1,3 ATP por CO2 fijado.

La selección de un orden de implementación alternativo para los cuatro pasos mínimos de ingeniería conduce a una disminución del rendimiento del PCCM en las etapas intermedias. Por ejemplo, agregar canales de HCO3- en las membranas de los tilacoides antes de que se localicen las anhidrasas carbónicas del estroma y de los tilacoides (Fig. 8b, óvalo azul) conduce a ciclos inútiles generados por anhidrasas carbónicas superpuestas (Fig. 4, región ii). Además, agregar una vaina de almidón antes de agregar los canales de HCO3− a los tilacoides podría disminuir la fijación de CO2 (Fig. 8b, óvalo gris); sin canales, el HCO3− no puede difundirse fácilmente a la anhidrasa carbónica tilacoidea para producir CO2, y la cubierta de almidón impide la difusión de CO2 desde el estroma hasta Rubisco. Por lo tanto, nuestro camino sugerido evita configuraciones intermedias con menor eficacia o costo de energía excesivo.

Para comprender mejor la composición y la función de un PCCM mínimo, desarrollamos un modelo de reacción-difusión multicompartimental sobre la base del PCCM de Chlamydomonas. El modelo no solo da cuenta de todos los mutantes PCCM de Chlamydomonas publicados, sino que también sienta las bases cuantitativas y biofísicas para comprender los principios operativos de un PCCM mínimo. El análisis sistemático del modelo sugiere que las claves para un PCCM eficaz y energéticamente eficiente son las barreras que impiden la salida de CO2 de la matriz pirenoide y las localizaciones de anhidrasa carbónica que impiden los flujos inútiles de Ci. El modelo demuestra la viabilidad de la absorción pasiva de CO2 a nivel de CO2 en el aire y muestra que a niveles más bajos de CO2 externo, una PCCM efectiva requiere una importación activa de HCO3−. Ambas estrategias de captación pueden funcionar a un bajo costo de energía.

Si bien no se considera explícitamente en nuestro modelo, los protones se producen en reacciones de fijación de CO2 catalizadas por Rubisco y se consumen en conversiones de HCO3 a CO2 catalizadas por CAH3. Luego, los protones deben agotarse en la matriz pirenoide y reponerse en la luz de los tilacoides intrapirenoide para mantener los valores de pH fisiológicos41,43. Sin embargo, nuestro análisis de balance de flujo muestra que las concentraciones de protones libres son demasiado bajas para tener en cuenta los flujos esperados de agotamiento / reposición de protones por difusión de protones libres (Nota complementaria VI.D y Fig. 27). Por lo tanto, el transporte eficiente de protones debe emplear mecanismos alternativos. Una posibilidad, sugerida por un trabajo de modelado reciente70, es que los transportadores de protones como RuBP y 3-PGA podrían estar presentes en concentraciones milimolares71 y, por lo tanto, podrían permitir un flujo suficiente para transportar protones entre compartimentos. Comprender los mecanismos moleculares que subyacen al transporte de protones será un tema importante para futuros estudios.

Otra clase de CCM es el CCM basado en carboxisoma (CCCM) empleado por las cianobacterias13. En el CCCM, el HCO3− se concentra en el citosol a través del transporte activo72 y se difunde en los carboxisomas, compartimentos que suelen tener entre 100 y 400 nm de diámetro, cada uno compuesto por una cubierta de proteína icosaédrica que encierra Rubisco73. Se cree que la cubierta de proteína sirve como barrera de difusión, lo cual es necesario para una CCCM efectiva46,47. Mientras que la matriz de pirenoide no parece tener anhidrasa carbónica, la matriz de carboxisoma contiene una anhidrasa carbónica que convierte HCO3− en CO2 para alimentar localmente a Rubisco. Estudios recientes sugieren que los protones producidos durante la carboxilación de Rubisco podrían acidificar el carboxisoma, lo que a su vez favorece la producción de CO270 catalizada por la anhidrasa carbónica. Uno puede preguntarse: ¿cuáles son los beneficios de operar un PCCM versus un CCCM? Una posibilidad es que la PCCM utilice una organización espacial más compleja para segregar Rubisco de la anhidrasa carbónica de la luz de los tilacoides, lo que permite que las dos enzimas operen a valores de pH óptimos para sus respectivas funciones catalíticas. Por lo tanto, el PCCM puede requerir un depósito de Ci más pequeño que el CCCM para producir suficiente CO2 en las cercanías de Rubisco. De hecho, las cianobacterias parecen acumular aproximadamente 30 mM de HCO3−74 intracelular, mientras que Chlamydomonas crea una reserva interna de HCO3− de solo 1 mM76. La experimentación futura que compare el rendimiento del PCCM y el CCCM mejorará nuestra comprensión de los dos mecanismos distintos.

El PCCM tiene el potencial de ser transferido a las plantas de cultivo para mejorar los rendimientos. Nuestro modelo proporciona un marco para evaluar el rendimiento general, considerando tanto la eficacia como la eficiencia energética del PCCM (Fig. 28 complementaria), y nos permite proponer un orden preferido de pasos de ingeniería. Además, esperamos que nuestro modelo ayude a los ingenieros a reducir los desafíos potenciales al proporcionar un diseño mínimo para un PCCM funcional. Si las anhidrasas carbónicas de plantas nativas están inactivas o ausentes, podría ser favorable expresar y localizar otras anhidrasas carbónicas con actividades conocidas. Además, un paso clave será probar si los canales BST de Chlamydomonas expresados ​​heterólogamente funcionan como canales de HCO3− y verificar que no interfieren con los canales de iones nativos en las plantas. Esperamos que nuestro modelo brinde información práctica para los ingenieros que buscan instalar un PCCM mínimo en las plantas y que sirva como una herramienta cuantitativa útil para guiar los estudios básicos de PCCM en el futuro.

Para comprender mejor el funcionamiento del PCCM, desarrollamos un modelo de reacción-difusión multicompartimental sobre la base del mecanismo postulado en Chlamydomonas. El modelo tiene en cuenta las enzimas y transportadores PCCM clave y la arquitectura relevante del cloroplasto de Chlamydomonas48. Para simplificar, nuestro modelo asume simetría esférica y considera un cloroplasto esférico de radio Rchlor en un citosol infinito. Por lo tanto, todas las cantidades del modelo se pueden expresar como funciones de la distancia radial r desde el centro del cloroplasto (Fig. 1b). El cloroplasto modelado consta de tres compartimentos: una matriz pirenoide esférica de radio Rpyr (pH 8) en el centro, rodeada por un estroma (pH 8), con tilacoides (pH luminal 6) que atraviesan tanto la matriz como el estroma (Fig. 1) 41,42,43. En estado estacionario, las ecuaciones de balance de flujo establecen las concentraciones espacialmente dependientes de CO2, HCO3− y H2CO3 en sus respectivos compartimentos (indicados por subíndices; consulte la Tabla complementaria 2 y la Nota I):

Aquí, C denota la concentración de CO2 y H denota la concentración combinada de HCO3− y H2CO3, que se supone que están en equilibrio rápido77. Por lo tanto, sus respectivas concentraciones están dadas por \(H^ - = \frac{\eta }{{1 + \eta }}H\) para HCO3− y \(H^0 = \frac{1}{{1 + \eta }}H\) para H2CO3, donde η = \(10^{{\mathrm{pH-pKa}}_1}\) es un factor de partición dependiente del pH y pKa1 = 3,4 es el logaritmo negativo del primer ácido constante de disociación de H2CO378. Los primeros términos de las ecuaciones (1a–1f) describen los flujos de difusión de carbono inorgánico (Ci) dentro de los compartimentos. DC y DH indican respectivamente los coeficientes de difusión de CO2 y HCO3− y H2CO3 combinados en solución acuosa. En un modelo con pilas de tilacoides que ralentizan la difusión de Ci en el estroma, los coeficientes de difusión efectivos DstrC/H se obtienen utilizando un enfoque de homogeneización estándar (consulte la Fig. 5 complementaria y la Nota IG); \(D_{{{{\mathrm{str}}}}}^{C/H} = D^{C/H}\) de lo contrario. Los otros términos de flujo (jX) en las ecuaciones (1a–1f) describen reacciones enzimáticas y transporte de Ci entre compartimentos, y los factores fs y fv describen la geometría de los tilacoides. Sus expresiones se proporcionan en secciones posteriores.

Las condiciones de contorno en r = Rpyr están determinadas por el flujo de difusión de Ci a través de la cubierta de almidón en la interfase matriz-estroma, es decir,

donde ∂r denota derivada con respecto a r, y se supone que la cubierta de almidón tiene la misma permeabilidad κalmidón para todas las especies de Ci. κalmidón→∞ cuando no hay una cubierta de almidón y Ci puede difundirse libremente fuera de la matriz. κstarch = 0 describe una cubierta de almidón impermeable (consulte la Nota complementaria IF). De manera similar, el flujo de transporte de Ci a través de la envoltura del cloroplasto produce las condiciones de contorno en r = Rchlor, es decir,

donde \(\kappa _{{{{\mathrm{cloro}}}}}^{H^ - }\) y γ indican la velocidad y la reversibilidad del transporte de HCO3− hacia el interior desde el citosol, lo que representa la acción del cloroplasto no caracterizado sobre transportador de HCO3− LCIA24,37; γ = 1 corresponde a un canal bidireccional pasivo y γ < 1 corresponde a una bomba activa. Las condiciones de CO2 externo se especifican mediante la concentración de CO2 citosólico Ccyt. Establecemos Ccyt = 10 μM para condiciones de CO2 a nivel de aire, y Ccyt = 1 μM para condiciones de CO2 muy bajo. A menos que se especifique lo contrario, se supone que todas las especies Ci citosólicas están en equilibrio a un pH de 7,154.

La geometría de los tilacoides ha sido caracterizada por tomografía crioelectrónica en Chlamydomonas48. En nuestro modelo, explicamos esta geometría variando la fracción de volumen local fv y la relación superficie-volumen fs de los tilacoides. Estas fracciones describen una red de túbulos en el centro del pirenoide (r ≤ Rmesh), extendida radialmente por Ntub túbulos cilíndricos, cada uno de radio atub (ver la Nota complementaria IC), es decir,

En el modelo de referencia, se supone que los túbulos tilacoides se extienden hasta la envoltura del cloroplasto, es decir, el radio exterior de los túbulos Rtub = Rchlor. En un modelo con túbulos más cortos, elegimos \(R_{{{{\mathrm{tub}}}}} = 0.4\,R_{{{{\mathrm{cloro}}}}}\), y establecemos fv = 0 y fs = 0 para r > Rtub. Por lo tanto, los operadores de Laplace-Beltrami en la ecuación (1) están dados por \(\nabla_{{{{\mathrm{thy}}}}}^2 = r^{ - 2}f_{{{\mathrm{v }}}}^{ - 1}\parcial _rf_{{{\mathrm{v}}}}r^2\parcial _r\) para los túbulos tilacoides, y por \(\nabla__{{{{\mathrm{ pir}}}}}^2 = \nabla _{{{{{\mathrm{str}}}}}^2 = r^{ - 2}(1 - f_{{{\mathrm{v}}}}) ^{ - 1}\parcial _r(1 - f_{{{\mathrm{v}}}})r^2\parcial _r\) para la matriz y el estroma.

El modelo considera tres enzimas clave PCCM de Chlamydomonas, es decir, las anhidrasas carbónicas (CA) CAH3 y LCIB y la enzima fijadora de CO2 Rubisco. La interconversión entre CO2 y HCO3− está catalizada por ambos CA y sigue la cinética reversible de Michaelis-Menten79. La tasa de conversión de CO2 a HCO3 mediada por CA viene dada por

donde \(V_{{{{\mathrm{max}}}},{{{\mathrm{CA}}}}}^C\) denota la tasa máxima de CA, \(K_{{{\mathrm{m }}}}^C\) y \(K_{{{\mathrm{m}}}}^{H^ - }\) respectivamente indican las concentraciones de saturación media para CO2 y HCO3−, y \(V_{{ {{\mathrm{max}}}},{{{\mathrm{CA}}}}}^C/K_{{{\mathrm{m}}}}^C\) denota la constante de velocidad de primer orden que nos referimos como la 'tasa' de la CA (Fig. 2). Finalmente, \(K^{{{{\mathrm{eq}}}}} = 10^{{{{\mathrm{pK}}}}_{{{{\mathrm{eff}}}}} - { {{\mathrm{pH}}}}}\) denota la relación de equilibrio de CO2 a HCO3−, donde el pKa efectivo viene dado por \({{{\mathrm{pK}}}}_{{{{\mathrm {ef}}}}} = 6.1\)8 La función de localización \({{{\mathcal{L}}}}_{{{{\mathrm{CA}}}}}\) es igual a uno para r donde CA está presente y cero en cualquier otro lugar. La tasa espontánea no catalizada de conversión de CO2 a HCO3−, con una constante de tasa de primer orden \(k_{{{{\mathrm{sp}}}}}^C\), está dada por \(j_{{{ {\mathrm{sp}}}}} = k_{{{{\mathrm{sp}}}}^C(C - K^{{{{\mathrm{eq}}}}}H^ - )\ ) 82. Tenga en cuenta que los valores negativos de jCA y jsp indican flujos de conversión de CO2 a HCO3−.

La tasa de fijación de CO2 catalizada por Rubisco se calcula a partir de

Aquí, \(V_{{{{\mathrm{max}}}},{{{\mathrm{Rbc}}}}}^C\) denota la tasa máxima y el Km efectivo (Km Rubisco en la Fig. 1 ). ) viene dado por \(K_{{{\mathrm{m}}}}^{{{\mathrm{eff}}}}} = K_{{{{\mathrm{m}}}},{ {{ \mathrm{Rbc}}}}}^C(1 + O/K_{{{{\mathrm{m}}}},{{{\mathrm{Rbc}}}}}^O)\) a explicar la inhibición competitiva por O283.84, donde O denota la concentración de O2, y \(K_{{{{\mathrm{m}}}},{{{\mathrm{Rbc}}}}}^C\) y \ (K_{{{{\mathrm{m}}}},{{{\mathrm{Rbc}}}}}^O\) denotan las concentraciones de sustrato a la mitad de la saturación para CO2 y O2, respectivamente. \({{{\mathcal{L}}}}_{{{{\mathrm{Rbc}}}}}\) es igual a uno donde se localiza Rubisco y cero en cualquier otro lugar.

En nuestro modelo de referencia, suponemos que CAH3 se localiza en los túbulos tilacoides que atraviesan el pirenoide40, LCIB se distribuye de forma difusa en el estroma57 y Rubisco se localiza en la matriz pirenoide16. Para explorar el efecto de la localización de enzimas, variamos los radios de inicio y finalización de las enzimas mientras mantenemos un número constante de moléculas (Figs. 4 y 5, y la Nota complementaria III).

El flujo de CO2 que se difunde a través de la membrana del tilacoides desde la luz del tilacoides hasta la matriz o el estroma viene dado por

donde κC denota la permeabilidad de las membranas de los tilacoides al CO2. De manera similar, el flujo de difusión a través de la membrana de HCO3− y H2CO3, \(j_{{{{\mathrm{mem}}}}}^H\), está dado por

donde \(\kappa^{H^-}\) y \(\kappa^{H^0}\) respectivamente indican la permeabilidad de la membrana de referencia al HCO3− y al H2CO3, y \(\kappa_{{{{\mathrm {thy}}}}}^{H^ - }\) denota la permeabilidad adicional de las membranas de los tilacoides al HCO3− debido a los canales similares a la bestrofina25. Tenga en cuenta que los términos finales de las ecuaciones (1a) y (1a–1c) difieren por un factor de \(\frac{{f_{{{\mathrm{v}}}}}}{{1 - f_{{{\ mathrm{v}}}}}}\) porque los flujos a través de la membrana tienen un mayor impacto en las concentraciones en el compartimento tilacoidal, que tiene una fracción de volumen más pequeña.

Los parámetros del modelo se estimaron a partir del experimento (consulte la Tabla complementaria 2 y las referencias que contiene), excepto las tasas de LCIB y CAH3 y los parámetros cinéticos de los transportadores de HCO3−, que no se conocen. Realizamos una exploración sistemática de estos parámetros desconocidos dentro de un rango de valores razonables (Fig. 2 y Fig. 4 complementaria). Las soluciones numéricas de la ecuación (1) se obtuvieron realizando simulaciones utilizando un método de elementos finitos. Las ecuaciones diferenciales parciales se convirtieron a sus formas débiles equivalentes, se discretizaron computacionalmente mediante elementos de primer orden85 y se implementaron en la plataforma informática de código abierto FEniCS86. Se realizó un análisis de sensibilidad de parámetros para verificar la solidez de los resultados del modelo (Fig. 30 complementaria). Se realizó un estudio de convergencia para garantizar una discretización espacial suficiente (Fig. 31 complementaria).

Calculamos el costo energético utilizando el marco de la termodinámica de no equilibrio56 (consulte la Nota complementaria II.B para obtener más detalles). En resumen, el costo de energía libre de cualquier proceso fuera del equilibrio (reacción, difusión o transporte) viene dado por (j+ −j−)ln(j+/j−) (en unidades de energía térmica RT), donde j+ y j− denote el flujo hacia adelante y hacia atrás, respectivamente. Sumando el costo energético de los procesos de no equilibrio descritos en la ecuación (1), mostramos que la energía total requerida para operar el PCCM se puede aproximar (en unidades de RT) por

Aquí, \(J_{{{{\mathrm{str}}}}}^{C\to H^ - } = - {\int}_0^{R_{{{{\mathrm{cloro}}}}} } {4\mathrm{\pi} r^2(1 - f_{{{\mathrm{v}}}})(j_{{{{\mathrm{LCIB}}}}} + j_{{{{\ mathrm{sp}}}}})dr}\) integra el flujo de conversión espontánea y mediada por LCIB de CO2 a HCO3− en el estroma, siendo 4πr2(1 − fv)dr el factor geométrico. \(J_{{{{\mathrm{cloro}}}}}^C = 4\pi R_{{{{\mathrm{cloro}}}}}^2\kappa ^C(C_{{{{\mathrm {str}}}}}|_{r = R_{{{{\mathrm{cloro}}}}}} - C_{{{{\mathrm{cyt}}}}}\) denota el flujo de CO2 que se difunde desde el estroma hacia el citosol. \(J_{{{{\mathrm{Rbc}}}}} = {\int}_0^{R_{{{{\mathrm{cloro}}}}}} {4\pi r^2(1 - f_ {{{\mathrm{v}}}})j_{{{{\mathrm{Rbc}}}}}dr}\) integra el flujo de fijación de CO2 por Rubisco. El lnγ−1 y \({{{\mathrm{ln}}}}({K_{{{{\mathrm{thy}}}}}^{{{{\mathrm{eq}}}}}}/ Los términos {K_{{{{\mathrm{str}}}}}^{{{{\mathrm{eq}}}}})\) denotan el costo de energía libre de bombear HCO3− a través de la envoltura del cloroplasto y bombear protones a través de las membranas tilacoides, respectivamente. Usando la energía de hidrólisis de ATP \(|{\Delta}G_{ATP}|=51.5\,RT\)87, calculamos el ATP equivalente gastado por CO2 fijado como \(\dot W_{{{{\mathrm{PCCM} }. }}}/J_{{{{\mathrm{Rbc}}}}}/|{\Delta}G_{{{{\mathrm{ATP}}}}}|\).

Para comprender mejor el límite biofísico del PCCM, consideramos una simplificación de compartimentos bien mezclados del modelo completo. Específicamente, asumimos que (i) la difusión de Ci es rápida en la matriz y el estroma y, por lo tanto, las concentraciones de CO2 y HCO3− son constantes a lo largo de los radios en cada uno de los dos compartimentos, tomando valores indicados por \(C_{{{ {\mathrm{pir}}}}},C_{{{{\mathrm{str}}}}},H_{{{{\mathrm{pir}}}}}^ -\) y \(H_{{ {{\mathrm{cadena}}}}}^ -\); (ii) el transporte de HCO3− a través de las membranas de los tilacoides es rápido y, por lo tanto, la concentración de HCO3− en los túbulos tilacoides dentro del pirenoide es igual a \(H_{{{{\mathrm{pyr}}}}}^ -\), mientras que la concentración de túbulos tilacoides fuera del pirenoide es igual a \(H_{{{{\mathrm{str}}}}}^ -\); (iii) HCO3− y CO2 están en equilibrio (catalizados por CAH3) en los túbulos tilacoides dentro del pirenoide y, por lo tanto, la concentración de CO2 allí está dada por \(C_{{{{\mathrm{thy}}}}} = K_ {{{{\mathrm{tus}}}}}^{{{{\mathrm{eq}}}}}H_{{{{\mathrm{pyr}}}}}^ -\); y (iv) la concentración de CO2 en los túbulos tilacoides se aproxima a Cstr hacia la envoltura del cloroplasto. Por lo tanto, las condiciones de equilibrio de flujo se describen mediante un conjunto de ecuaciones algebraicas de 4 variables, \(C_{{{{\mathrm{pyr}}}}},C_{{{{\mathrm{thy}}}}} ,C_{{{{\mathrm{str}}}}}\) y \(H_{{{{\mathrm{str}}}}}^ -\) (véanse las Notas complementarias IV y V). Las ecuaciones algebraicas se resuelven utilizando la biblioteca informática basada en Python SciPy (versión 1.5.0)88. El costo energético del modelo de compartimiento bien mezclado se calcula de manera similar al anterior.

Estamos interesados ​​en cómo la adición y eliminación de componentes individuales afecta el funcionamiento general del PCCM. Así, medimos la eficacia y la eficiencia energética de 216 configuraciones de PCCM, modulando la presencia y localización de enzimas, canales de HCO3− y barreras de difusión. Cada configuración se simuló utilizando el modelo de reacción-difusión anterior, con los parámetros apropiados para esa estrategia (Fig. 26 complementaria).

Para encontrar todos los caminos de ingeniería posibles entre estas configuraciones, consideramos un gráfico en el que cada configuración posible es un nodo. Se consideró que los nodos estaban conectados por un borde no dirigido si estaban separados por un paso de ingeniería. Por lo tanto, al dar pasos en el gráfico, buscamos todas las rutas de ingeniería posibles, dado un nodo de inicio con un bajo rendimiento de PCCM y un nodo de destino con un buen rendimiento. Un solo paso de ingeniería podría ser la adición o eliminación de una enzima, un canal o una barrera de difusión, así como la localización de una sola enzima. La excepción es la localización de Rubisco, que asumimos puede excluir LCIB de la matriz ya que forma un condensado de separación de fases26. No consideramos estrategias que emplearan tanto una vaina de almidón como pilas de tilacoides como barreras de difusión. Utilizamos un algoritmo personalizado de búsqueda en profundidad en MATLAB (R2020a) para identificar todas las rutas de ingeniería más cortas entre un nodo de inicio y uno de destino.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo y en las tablas complementarias. Los conjuntos de datos sin procesar se han depositado en el repositorio de Zenodo en https://doi.org/10.5281/zenodo.6406849.

Los códigos de simulación personalizados están disponibles en GitHub en https://github.com/f-chenyi/Chlamydomonas-CCM.

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Agradecemos a los miembros de los grupos Jonikas y Wingreen por sus interesantes debates. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud a través de la subvención 5R01GM140032-02 (NSW y MCJ); la Fundación Nacional de Ciencias a través de la subvención MCB-1935444 (MCJ) ya través del Centro para la Física de la Función Biológica PHY-1734030 (NSW); y la Fundación Simons y el Instituto Médico Howard Hughes otorgan 55108535 (MCJ). MCJ es investigador del Instituto Médico Howard Hughes. Los esquemas para un subconjunto de figuras se crearon con BioRender.com.

Estos autores contribuyeron igualmente: Chenyi Fei, Alexandra T. Wilson.

Departamento de Biología Molecular, Universidad de Princeton, Princeton, NJ, EE. UU.

Chenyi Fei, Alexandra T. Wilson, Ned S. Wingreen y Martin C. Jonikas

Instituto Lewis-Sigler de Genómica Integrativa, Universidad de Princeton, Princeton, NJ, EE. UU.

Chenyi Fei y Ned S. Wingreen

Departamento de Biología, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Alexandra Wilson

Departamento de Ciencias de la Ingeniería y Matemáticas Aplicadas, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Niall M. Mangan

Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de Princeton, Princeton, Nueva Jersey, EE. UU.

Martín C. Jonikas

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investigación diseñada por CF, ATW, NMM, NSW y MCJ; CF, ATW, NMM y NSW realizaron el modelado; CF y ATW realizaron simulación; CF, ATW, NMM, NSW y MCJ analizaron datos; y CF, ATW, NMM, NSW y MCJ escribieron el manuscrito.

Correspondencia con Niall M. Mangan, Ned S. Wingreen o Martin C. Jonikas.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Plants agradece a Yusuke Matsuda y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Notas complementarias I–VI, Figs. 1–31 y tablas 1–4.

Cuadros complementarios 5 y 6.

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Reimpresiones y permisos

Fei, C., Wilson, AT, Mangan, NM et al. Modelar el mecanismo de concentración de CO2 basado en pirenoides proporciona información sobre sus principios operativos y una hoja de ruta para su ingeniería en cultivos. Nat. Plantas 8, 583–595 (2022). https://doi.org/10.1038/s41477-022-01153-7

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Recibido: 04 Agosto 2021

Aceptado: 11 de abril de 2022

Publicado: 19 mayo 2022

Fecha de emisión: mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-022-01153-7

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