La arquitectura y el mecanismo operativo de un orgánulo punzante cnidario

Jul 09, 2023

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3494 (2022) Citar este artículo

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Los orgánulos punzantes de las medusas, las anémonas de mar y otros cnidarios, conocidos como nematocistos, son armas celulares notables que se utilizan tanto para la depredación como para la defensa. Los nematocistos consisten en una cápsula presurizada que contiene un hilo enrollado en forma de arpón. Estas estructuras se construyen a su vez dentro de células especializadas conocidas como nematocitos. Cuando se activa, la cápsula se descarga explosivamente, expulsando el hilo enrollado que perfora el objetivo y se alarga rápidamente al volverse del revés en un proceso llamado eversión. Debido a la complejidad estructural del hilo y la extrema velocidad de descarga, la mecánica precisa de la activación de nematocistos ha permanecido difícil de alcanzar7. Aquí, utilizando una combinación de imágenes en vivo y de súper resolución, microscopía electrónica 3D y perturbaciones genéticas, definimos la secuencia paso a paso de la operación de nematocistos en la anémona de mar modelo Nematostella vectensis. Este análisis revela las complejas transformaciones biomecánicas que sustentan el mecanismo operativo de los nematocistos, una de las micromáquinas biológicas más exquisitas de la naturaleza. Además, este estudio proporcionará información sobre la forma y la función de los orgánulos cnidarios relacionados y servirá como plantilla para el diseño de microdispositivos bioinspirados.

Los nematocistos cnidarios son armas subcelulares complejas con formas y funciones altamente especializadas1,2. Los nematocistos son orgánulos intracelulares derivados de Golgi compuestos por hilos venenosos encerrados dentro de una cápsula presurizada3,4. Cuando se activa, la cápsula se descarga, expulsando su hilo como un arpón que penetra en los objetivos, liberando un cóctel de neurotoxinas5,6,7,8,9,10. A nivel celular, la descarga de nematocistos se encuentra entre los procesos mecánicos más rápidos de la naturaleza, y se sabe que se completa en 3 milisegundos en los nematocistos de Hydra11,12. Las mediciones realizadas en video de alta velocidad de estenoteles de Hydra revelan que la fase inicial de la explosión de la cápsula impulsada por la presión y la posterior expulsión del hilo ocurren en tan solo 700 nanosegundos12. Esta etapa inicial de descarga explosiva es comparable a otros sistemas de proyectiles ultrarrápidos que se encuentran en la naturaleza, como la descarga de esporas de hongos, la eyección de polen y la descarga de organelos balísticos de dinoflagelados13,14.

Estudios previos indican que la alta velocidad de descarga del nematocisto es impulsada por la acumulación de presión osmótica dentro de la cápsula por una matriz de polímeros de poli-γ-glutamato (PG) que se unen a cationes y la pared de la cápsula estirada elásticamente que libera energía por un poderoso resorte. como mecanismo durante la descarga2,12,15,16. Al activarse, pero antes de la descarga, la cápsula duplica aproximadamente su volumen debido a la rápida entrada de agua17. Esto hace que la matriz se hinche osmóticamente y estire la pared de la cápsula2,18. Esta energía se utiliza posteriormente para expulsar el hilo a alta velocidad, que impacta y penetra en el tejido objetivo. Las últimas fases de la descarga del nematocisto involucran el alargamiento del hilo, que avanza en una escala de tiempo más lenta y se completa en milisegundos11. Durante esta fase, el hilo del nematocisto sufre una transformación de forma, dándose la vuelta a través de un proceso llamado eversión que es causado por la liberación tanto de la presión generada osmóticamente como de la energía elástica almacenada en el hilo17,19,20. Así, el nematocisto opera en distintas fases que implican una fase inicial de perforar el objetivo y fases posteriores de eversión para formar un lumen.

Las características de los nematocistos varían significativamente entre las diferentes especies de cnidarios, exhibiendo diversidad en el tamaño de la cápsula y la morfología del hilo, pero todos conservan un mecanismo de operación similar que involucra un túbulo evertible impulsado por la eyección explosiva2,21,22,23. Para explorar la biología de los nematocistos en un sistema manejable genéticamente, aquí interrogamos el funcionamiento del hilo de nematocistos en la anémona de mar Nematostella vectensis. Nematostella alberga dos tipos de nematocistos: p-mastigoforos microbásicos e isorizas basítricas, esta última con variedades cortas y largas24,25. En las anémonas de mar, las cápsulas de los nematocistos están selladas por tres colgajos apicales conectados al hilo urticante26,27,28. Este hilo se compone de dos subestructuras distintas: un eje corto, rígido y fibroso y un túbulo largo y delgado decorado con púas17,22. El eje está compuesto por tres filamentos enrollados helicoidalmente y se expulsa inicialmente como un proyectil comprimido, perforando el objetivo, y luego se evierte para formar un lumen a través del cual se libera el resto del hilo, el túbulo17. Si bien se sabe que la eversión del eje implica una transformación geométrica de una bobina fuertemente comprimida a una jeringa hueca, los mecanismos que impulsan este proceso son poco conocidos. Además, la eversión del túbulo difiere significativamente de la del eje helicoidal triple, ya que el túbulo se evierte al girar del revés en ausencia de filamentos helicoidales26,29. La liberación de presión y energía elástica almacenada en la cápsula es teóricamente suficiente para impulsar la expulsión inicial y la penetración del eje; sin embargo, es probable que se requieran fuentes de energía adicionales para una mayor elongación del hilo5,19,20. Debido a la velocidad y la complejidad de estos eventos, las etapas precisas de descarga y eversión hasta ahora han permanecido difíciles de alcanzar.

Aquí, demostramos la composición estructural y las transformaciones mecánicas tanto del eje como del túbulo durante las distintas fases de la descarga de nematocistos en Nematostella, y además informamos sobre el mecanismo operativo de las subestructuras de hilos de nematocistos. Nuestro análisis revela la estructura compleja y las transformaciones biomecánicas sofisticadas que sustentan el mecanismo operativo de los nematocistos.

Para comprender la distribución de las células urticantes (nematocitos) y sus nematocistos en Nematostella, primero creamos una línea transgénica que expresa EGFP en nematocitos bajo el control de la región promotora de nematogalectina (nematogalectina> EGFP; Fig. 1a). La nematogalectina es un componente principal del nematocisto y se incorpora a la estructura del hilo durante su morfogénesis30. Se cree que esta proteína actúa como sustrato para el ensamblaje de otras proteínas estructurales en el hilo, por lo que su expresión temporal define una ventana útil para visualizar nematocitos30. Las imágenes en vivo de pólipos primarios transgénicos mostraron que los tentáculos estaban muy poblados con nematocitos EGFP+ que portaban los basítricos de forma larga (Fig. 1aI). La columna del cuerpo se pobló con la variedad más corta junto con unos pocos mastigoforos p. Curiosamente, encontramos que los nematocitos estaban conectados a través de procesos similares a neuritas que formaban redes locales (Fig. 1aII, flecha). Se sabe que los nematocitos forman sinapsis y actúan como aferentes o efectores, pero también pueden funcionar de forma autónoma celular31,32,33,34. Por lo tanto, las redes observadas podrían funcionar en la regulación del comportamiento colectivo y la actividad coordinada de las poblaciones de nematocitos35. En los nematocitos EGFP+, se detectó fluorescencia en todo el citoplasma y el aparato sensorial, pero se excluyó de la cápsula (Fig. 1b). La pared de la cápsula y el hilo están construidos, en parte, de minicolágenos que permiten la construcción de una variedad de fibras estructurales mediante enlaces cruzados36,37,38,39,40,41. Aprovechamos esto para visualizar el contenido de la cápsula al tratar animales vivos con TRITC fluorescente que se incorporó al hilo del nematocisto durante su maduración, presumiblemente a través de una reacción con minicolágenos42,43.

a Nematocitos (verde) de un pólipo primario transgénico de N. vectensis que expresa EGFP bajo el control del promotor de nematogalectina aI expresión de EGFP en la punta del tentáculo. toda la expresión de EGFP en la columna del cuerpo. La flecha apunta a la red de procesos celulares que conectan los nematocitos. Las imágenes son representativas de pólipos primarios, tentáculos y columnas corporales de 6 desoves. b Vista de primer plano de un solo nematocito en la columna del cuerpo de un pólipo primario que expresa EGFP en nematocitos (verde). Se muestran el aparato cnidocil (sensor), el cuerpo celular y los procesos similares a las neuritas. TRITC (magenta) etiqueta la cápsula, el eje central y los pliegues del túbulo (n = 10 columnas de cuerpo de pólipo primario, cinco experimentos). c Morfologías de nematocistos en N. vectensis basadas en la señal de fluorescencia del TRITC incorporado. Cápsulas de basitrichous isorhizas (n = 19 cortas, n = 20 largas) con eje densamente etiquetado (flecha) y túbulo enrollado (flecha discontinua) continuo con el eje comprimido (paneles izquierdo y central). Cápsulas microbásicas de p-mastigoforos (n = 10) eje (flecha) con su distintiva muesca en forma de V (panel derecho, flecha discontinua) Imágenes representativas de nematocistos purificados de ~300 pólipos primarios). Barras de escala de 1 μm. d Sección longitudinal de un nematocisto que muestra filamentos del eje densamente enrollados (azul), una porción del túbulo enrollado (magenta) y las dos regiones del conector, el conector cápsula-eje y el conector eje-túbulo (amarillo). Los colgajos apicales se ven en una conformación parcialmente abierta (recuadro punteado). La reconstrucción 3D correspondiente de la sección longitudinal muestra la cápsula, el eje central (azul), una parte del túbulo adjunto (magenta), las regiones conectoras (amarillo) y los colgajos apicales (cuadro punteado). e Sección transversal de un nematocisto que muestra la pared de la cápsula, el eje lamelar denso y el túbulo en forma de hélice. (n = 2 imágenes de cápsulas de volumen completo de ~350 cápsulas visibles en 2 muestras de pólipos primarios.

En los nematocistos de tipo basitrich, la incorporación de TRITC se observó solo después de la invaginación del hilo (Fig. 1a complementaria, flechas). Por el contrario, los nematocitos que albergaban hilos en maduración carecían de TRITC (Fig. 1a complementaria, flechas discontinuas). Esto sugiere que el tinte se acumula específicamente en las partes invaginadas del hilo dentro de la cápsula. Descubrimos que la eliminación mediada por shRNA del gen similar a la nematogalectina Nemve1_232014 resultó en cápsulas anormales y evitó la formación de hilos (Fig. 1b complementaria). Esto sugiere que las lectinas desempeñan un papel fundamental en la morfogénesis del hilo y la cápsula (Figura complementaria 1b, flechas discontinuas). Además, confirmamos que la eliminación resultó en una reducción del doble de la expresión del ARNm de Nemve1_232014 por qPCR, lo que sugiere que esta proteína debe estar presente en abundancia para el ensamblaje adecuado del hilo y la cápsula (Fig. 1c complementaria). Utilizando una combinación de nematogalectina> EGFP y etiquetado de tinte TRITC, luego analizamos la arquitectura del hilo desde su desarrollo hasta su morfología final después del disparo (Fig. 1b, c; Película complementaria 1). En contraste con el eje denso de los mastigoforos p (Fig. 1c, flechas), en los que la intensidad del tinte era muy alta en comparación con el túbulo, el TRITC fluorescente se incorporó con una intensidad similar tanto en el eje como en el túbulo de los basitrichs (Fig. 1c, flechas discontinuas). El etiquetado más uniforme de basitrichs y su prevalencia en pólipos primarios nos llevó a investigar la operación de hilo en este tipo de nematocisto.

Para analizar la estructura del eje y el túbulo y, por lo tanto, determinar su funcionalidad, luego realizamos la reconstrucción en 3D de cápsulas de basitrich no descargadas a partir de secciones en serie utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM; Fig. 1d; Película complementaria 2). Descubrimos que el eje comprimido consistía en filamentos fuertemente enrollados alineados verticalmente con la abertura de la cápsula formada por las aletas apicales (Fig. 1d, recuadro). Los filamentos eran estructuras compuestas con pilas de láminas construidas a partir de capas densas en electrones y transparentes para electrones. Estos resultados confirman una estructura laminar de triplete similar a la observada en Anemonia sulcata por Godknecht y Tardent (1988), quienes notaron que la punta del eje está formada por laminillas escalonadas que convergen en un área pequeña que apunta hacia la apertura de la cápsula17.

Una inspección minuciosa de nuestros datos SEM reveló además que la pared del hilo que recubría los filamentos del eje estaba conectada a las aletas apicales con un conector suelto de cápsula a eje. Se ubicó un conector eje-túbulo similar entre el extremo basal del eje y el extremo apical del túbulo. El túbulo estaba retorcido, formando pliegues en segmentos longitudinales regulares (Películas complementarias 2, 3). En las secciones transversales de la cápsula, se observó que las láminas del eje estaban fuertemente enrolladas y comprimidas, mientras que la sección transversal del túbulo mostraba una estructura en forma de hélice (Fig. 1e; Película complementaria 4).

Para determinar las distintas fases de la operación del hilo, luego grabamos películas fluorescentes de alta velocidad de eventos de descarga en animales etiquetados con TRITC (Películas complementarias 5–7). Después de la estimulación de nematocitos in situ, el eje comprimido se expulsó primero como un proyectil denso que luego se expandió rápidamente para formar un cilindro alargado a través del cual emergió el túbulo (Fig. 2aII-aIV, flechas; Película complementaria 5). Con base en estas observaciones, definimos tres fases principales de la operación del nematocisto: descarga del eje (Fase I), eversión del eje (Fase II) y eversión del túbulo (Fase III; Fig. 2, recuadro). Usando SEM, visualizamos la ultraestructura del eje de descarga. En el estado no descargado, observamos laminillas escasas que decoraban la región donde el eje se estrechaba hacia el conector cápsula-eje (Fig. 2b, flecha discontinua). Durante las primeras etapas de la descarga, el conector cápsula-eje evertido formó un faldón alrededor del eje transversal, creando una estructura de doble pared (Fig. 2c, flecha) con el eje no evertido moviéndose hacia adelante dentro del conector (Fig. 2c, azul) . El conector cápsula-eje evertido estaba cubierto externamente con filamentos escasos que se asemejaban a espinas irregulares que se originaban en la eversión de las laminillas observadas en estado no descargado (Fig. 2c, flecha discontinua). Las secciones SEM en serie también capturaron un conector evertido (Fig. 2d, flecha) en el que se podía observar el túbulo saliendo de la cápsula (Fig. 2d, flecha discontinua; Película complementaria 8). Finalmente, en secciones SEM de un hilo de nematocisto parcialmente descargado, observamos el túbulo no evertido atravesando el interior de su fracción evertida, que estaba decorada externamente con púas huecas (Fig. 2e, flecha; Película complementaria 9).

una imagen en vivo de la descarga de nematocistos. Los nematocistos marcados con TRITC se descargaron in vivo y los fotogramas se capturaron a intervalos de 5 milisegundos. Instantáneas aI–aIV que muestran distintas fases correspondientes a la descarga del eje y la elongación del túbulo. Nota: La eversión del eje (Fase II) fue demasiado rápida para ser capturada en esta secuencia. b Sección longitudinal de una cápsula (C) antes de la descarga que muestra el eje no evertido (US) y su conicidad (flecha discontinua) al conector del eje-túbulo (flecha amarilla), las aletas apicales (en forma de V) y el eje no evertido túbulo (magenta). c Sección longitudinal de una cápsula descargada durante la eversión del eje. Los filamentos del eje no evertidos (EE. UU., azul), el conector cápsula-eje (fuera de la cápsula, amarillo), una porción del túbulo (magenta) y el conector eje-túbulo (amarillo). La estructura de doble pared (flecha) y escasa Se mostraron laminillas en el exterior del conector (flecha discontinua). d Sección longitudinal de un conector eje-cápsula evertido (amarillo, flechas) y túbulo no evertido que atraviesa (UT, magenta, flecha discontinua). e Sección longitudinal de un túbulo parcialmente evertido. Se muestran el eje evertido (ES, azul, flecha), el conector cápsula-eje (amarillo, flecha discontinua), partes del túbulo no evertido (UT, magenta) dentro del túbulo evertido (ET) y las púas (B). f Un hilo de nematocisto parcialmente evertido revelado por la incorporación de TRITC que muestra los filamentos del eje evertido (ES), el túbulo no evertido (UT, centro) y las púas (B) que decoran la porción evertida del túbulo (ET). Secciones transversales EM correspondientes: fI Sección transversal del túbulo. Las etiquetas indican los segmentos de túbulos evertidos y no evertidos con púas (B) ubicadas en el centro. fII Sección oblicua del túbulo parcialmente evertido que muestra segmentos de túbulos y púas en el exterior (B). fIII Sección transversal del eje evertido (ES) y el túbulo no evertido transversal (UT). Se muestran las capas electro-densas y translúcidas de los filamentos ES (flecha). g Un nematocisto parcialmente descargado teñido con aglutinina de germen de trigo conjugado con tinte fluorescente (WGA, magenta) y TRITC (verde). Regiones magnificadas: gI El conector entre el eje y el túbulo (flecha) y el túbulo evertido que emerge con púas (flecha discontinua). gII Los filamentos del eje (verde, flecha) y la pared del hilo con la etiqueta WGA (magenta). gIII El conector cápsula-eje (flecha) que muestra la pared de la rosca (WGA, magenta) y el túbulo no evertido transversal (TRITC, verde, flecha discontinua). h Imágenes representativas de las distintas fases de eversión del hilo. La tinción fluorescente muestra las transformaciones geométricas en cada fase. Las flechas indican el ápice del hilo durante distintas fases.

Para comprender mejor los cambios estructurales descritos anteriormente, a continuación analizamos imágenes de súper resolución de subprocesos etiquetados con TRITC que experimentan eversión. Este enfoque nos permitió demostrar la existencia de una geometría helicoidal triple de los filamentos del eje desenrollados junto con el túbulo no evertido transversal que podría rastrearse mediante el etiquetado de las púas (Fig. 2f). Curiosamente, la pared del hilo no incorporó TRITC y era invisible en las imágenes fluorescentes, pero se podía ver en las secciones transversales SEM correspondientes como una capa transparente a los electrones que encerraba el túbulo no evertido en su estado compactado (Fig. 2fI, fII). La disposición altamente ordenada de las púas dentro del túbulo no evertido indica que estas estructuras están apiladas como una columna, que apareció como un solo filamento en las imágenes fluorescentes (Fig. 2f, fI). Además, las secciones transversales de SEM a través del eje mostraron que sus filamentos consistían en láminas que encerraban el túbulo transversal no evertido, como se ve en las imágenes fluorescentes (Fig. 2f, fIII, flecha).

Para visualizar la pared del hilo que de otro modo sería invisible en las imágenes ópticas, luego enfocamos nuestra atención en otros componentes del hilo. Junto con los minicolágenos, los nematocistos de Hydra y Nematostella contienen glicanos y muestran similitudes con la matriz extracelular en su composición44,45,46,47,48. La lectina específica de nematocistos, Nematogalectin, actúa como un andamio que une los minicolágenos con los glicanos, y consiste principalmente en una vaina de condroitina no sulfatada30,46,49. Teniendo en cuenta la presencia de lectinas en la estructura, planteamos la hipótesis de que la presencia de GAG ​​podría detectarse con lectinas de unión a azúcar marcadas con fluorescencia. Por lo tanto, teñimos los nematocistos descargados con aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugada con tinte fluorescente, que es selectiva para las cadenas de GlcNAc, y descubrimos que WGA se unía fuertemente a la pared del hilo transparente a los electrones (Fig. 2g) 50. La co-tinción con WGA y TRITC mostró que el material teñido con WGA no se colocalizaba con TRITC, sino que formaba un laminado con las estructuras marcadas con TRITC. Finalmente, las imágenes de hilos en un estado evertido temprano mostraron que el eje marcado con TRITC rodeaba la pared del túbulo marcada con WGA. Las regiones del conector que carecían de filamentos o púas que estaban mal marcadas con TRITC estaban más fuertemente marcadas con WGA fluorescente (Fig. 2gI-gIII).

Es importante destacar que observamos que el etiquetado TRITC se superpuso con los filamentos del eje en el canal de transiluminación, lo que sugiere que las fibras del eje albergan material etiquetado con TRITC (Fig. 2a complementaria, flechas). Por el contrario, el etiquetado WGA fluorescente se enriqueció en el interior, rodeando la estructura de la pared. La capa WGA formó laminillas repetitivas con las regiones etiquetadas con TRITC, pero no se superpuso con el material etiquetado con TRITC (Fig. 2b, c complementarias, TRITC, flechas; WGA, flechas discontinuas). Al combinar el etiquetado TRITC y WGA con la tinción de anticuerpos del minicolágeno Ncol4, determinamos que la señal TRITC estaba presente en los hilos de las cápsulas maduras solo donde el hilo está invaginado. TRITC no marcó las cápsulas maduras, que se pueden teñir con minicollagen Ncol4 de Nematostella según lo informado por Zenkert et al. (2010)24,25. En las puntas de los tentáculos, las cápsulas en desarrollo en lo profundo del ectodermo se tiñeron con el anticuerpo Ncol4, mientras que las cápsulas completamente maduras que recubren la superficie del epitelio del tentáculo no se tiñeron (Figs. 3, 4, flechas complementarias). En conclusión, estos resultados sugieren que el hilo consta de dos capas: una capa marcada con TRITC que forma los filamentos y púas del eje detectables por TRITC, y una capa marcada con WGA que forma la pared cilíndrica general del hilo, incluidas las regiones del conector, la pared del eje, y pared del túbulo.

Los estudios estructurales de hilos de nematocistos que penetran sustratos de gel indican que la eversión del eje se inicia en el vértice del eje17. Para determinar cómo se transforma el eje de su estado comprimido a una estructura helicoidal triple suelta, capturamos las primeras etapas de la descarga al tratar los pólipos primarios de Nematostella con una solución que simultáneamente desencadena la descarga y fija rápidamente las muestras24. La secuencia reconstruida de eventos a partir de imágenes fijas reveló la compleja transformación geométrica del eje cuando salió de la cápsula en una configuración enrollada (Fig. 2h y Fig. 5a complementaria, flechas). Encontramos que durante la descarga del eje (Fase I), el eje expulsado continuó moviéndose hacia adelante como un proyectil denso dentro del conector cápsula-eje hasta que el conector se extendió a su longitud máxima. Durante la eversión del eje (Fase II), los filamentos comenzaron a desenrollarse desde el vértice del eje, girando de adentro hacia afuera, y por lo tanto evirtiéndose, mientras que el extremo basal del eje se movió hacia adelante dentro de los filamentos desenrollados (Fig. 5b complementaria). La punta evertida del eje exhibió una estructura similar a una punta de lanza (Fig. 5c complementaria, flecha). El túbulo se unió al extremo basal del eje a través del conector eje-túbulo y, por lo tanto, se tiró a través del lumen recién formado dentro de los filamentos del eje desenrollados. Este movimiento resultó en la eversión completa de los tres filamentos donde el antiguo extremo apical del eje se convirtió en su extremo basal. Finalmente, el lumen del eje evertido se abrió, permitiendo el movimiento del conector del túbulo del eje, iniciando la Fase III. La aparición de púas en el exterior del túbulo evertido demarcó un límite entre el conector del eje y el túbulo y el túbulo mismo y, por lo tanto, marcó el comienzo de la eversión del túbulo (Fig. 2gI; Fig. 2h, último panel. Fig. 5a complementaria, último panel) ). En conjunto, estos datos indican que la eversión del eje ejecuta una serie reproducible de transformaciones físicas que involucran el desenrollado y el movimiento hacia adelante de sus filamentos.

Las imágenes SEM y fluorescentes revelaron diferencias en la composición y estructura entre el eje fibroso de triple hélice y el túbulo cilíndrico liso (Fig. 3a, b). Si bien la eversión del eje puede explicarse por el movimiento de tres filamentos, el túbulo carece de esa geometría y probablemente se evierte por un mecanismo que implica el despliegue y la torsión de la pared del túbulo19,29. Las imágenes en vivo revelaron que durante la elongación del túbulo, el túbulo que se movía hacia adelante se desenroscó y se relajó a un estado cilíndrico (Fig. 2aIII-aIV; Fig. 3b, Etapas 1, 2; Película complementaria 5). En la punta de eversión, se podían ver los giros helicoidales del segmento del túbulo de eversión debido a la concentración de tinción WGA a lo largo de las bolsas de púas (Fig. 3c). Por el contrario, en una imagen capturada poco después del inicio de la eversión del túbulo, el túbulo se vio como una estructura cilíndrica de doble pared con un lumen entre las paredes evertidas y no evertidas, lo que sugiere que probablemente se relajó y se desenroscó rápidamente (Fig. 3d, flechas ). Estos resultados indican que la eversión del túbulo probablemente ocurre en etapas que involucran el desenroscado de su forma similar a una hélice a una conformación cilíndrica, y que la acción del desenroscado del segmento evertido y la relajación alimenta el túbulo no evertido restante hacia la punta distal.

una imagen SEM (n = 6, 2 experimentos) del eje (flecha), el túbulo y las púas dispuestas helicoidalmente (flecha discontinua). b Imagen fluorescente de un túbulo parcialmente evertido. Se muestran los filamentos del eje y las púas (TRITC, verde) y la pared del hilo (WGA, magenta) (n = 10 tentáculos de pólipos primarios, 3 experimentos). Barras de escala de 2 μm. c Imagen de súper resolución de la punta del túbulo evertido (Etapa 1) (n = 20 hilos de un tentáculo de pólipo primario). Se muestran las púas (TRITC, verde), el túbulo (WGA, magenta) y los canales combinados. Barras de escala de 0,5 μm. d La punta de un túbulo evertido (Etapa 2) (n = 8/30 hilos de doble pared de un tentáculo de pólipo primario). Se muestran la pared del túbulo (magenta), su estructura de doble pared (panel central izquierdo, flecha) y las púas (panel central derecho, flecha). Ilustración de la Etapa 2 (panel derecho). Barras de escala de 1 μm. e Estructura de las púas del túbulo (flechas) en control de codificación (n = 0/20 hilos parcialmente descargados de un tentáculo de pólipo primario) y v1g243188 (n = 20/20 hilos parcialmente descargados de un tentáculo de pólipo primario) muestras de shRNA KD (flecha discontinua ). El brillo se ajustó para visualizar los subprocesos v1g243188. Barras de escala de 2 μm. f Efectos del scramble y v1g243188 knockdown en las púas (TRITC, verde) y la pared del túbulo (WGA, magenta). Las flechas indican las púas desorganizadas (n = 25/25 hilos en comparación con scramble (n = 0/25 hilos). El brillo se ajustó para visualizar los hilos v1g243188. Representativo de hilos parcialmente descargados de tentáculos de pólipos primarios (Scramble, n = 27 hilos primarios). tentáculos de pólipos; v1g243188, n = 25 tentáculos de pólipos primarios, n = 5 experimentos de eliminación de shRNA). Barras de escala de 1 μm. g Un hilo completamente evertido etiquetado con TRITC y WGA (n = 15 hilos purificados y descargados). La flecha indica que se dobla en un sitio del túbulo distal gI Conector cápsula-diáfisis (flecha) y eje evertido (verde, flecha discontinua) gII Conector eje-túbulo (flecha) y eje evertido (flecha discontinua) gIII Pared del túbulo totalmente evertida (magenta) y las púas (verde) gIV Punta del hilo que muestra la pared del túbulo (magenta, flecha discontinua) escasamente decorada con púas (verde, flecha).

Hydraspinein es una proteína rica en glicina e histidina presente en las estructuras de la columna en la superficie del eje en los nematocistos de Hydra51,52. Para probar el papel de las púas apiladas centralmente en la eversión de los túbulos en Nematostella, usamos shRNA53,54 para derribar v1g243188, que anteriormente se informó que era un gen específico de nematocitos que codifica un producto similar a la espinalina55. Sin embargo, un análisis más detallado sugiere que v1g243188 codifica un factor similar a la fibroína bastante distante en la composición de la secuencia de Hydra spinein51,52, y no se identificaron ortólogos directos de Hydra spinein en Nematostella49. Sin embargo, descubrimos que la caída de v1g243188 resultó en filamentos de eje más delgados y débilmente etiquetados y, en algunos casos, interrumpió visiblemente la estructura de las púas. La pérdida de intensidad de TRITC indicó que una fracción del tinte también se incorporó a la estructura del eje, ya sea directa o indirectamente debido a la presencia de v1g243188. Si bien la caída interrumpió la estructura de las púas y su disposición (Fig. 3e, flechas), esto no pareció afectar el funcionamiento del hilo. Sin embargo, la pérdida de v1g243188 resultó en una mayor flexión del túbulo en comparación con los controles (Fig. 3e, flecha discontinua). Esta observación sugiere que v1g243188 es un componente del subproceso que juega un papel en su integridad estructural pero no en su funcionamiento. Además, notamos que la disposición helicoidal estereotipada de las púas y sus configuraciones apiladas se interrumpió en las muestras que mostraban los fenotipos más fuertes (Fig. 3f, flecha, Fig. 6a complementaria, recuadros). La medición de la intensidad de TRITC de las estructuras del eje en hilos descargados indicó que la incorporación de TRITC se redujo después de la caída de v1g243188, con una reducción aproximada del 65% en los niveles de ARNm (Fig. 6d, e complementarias). En los nematocistos descargados, el hilo completamente evertido parecía ser un tubo isodiamétrico compuesto por una pared etiquetada con WGA equipada con púas y filamentos de eje etiquetados con TRITC, excluyendo las regiones del conector (Fig. 3g, cuadros discontinuos). Las púas disminuyeron en densidad desde el extremo proximal al distal del túbulo y decoraron escasamente la región distal (Fig. 3gII-gIV). Presumimos que las púas, apiladas internamente antes de la eversión y distribuidas helicoidalmente externamente después de la eversión, podrían funcionar como un esqueleto que evita que el túbulo se elonge y se doble más. De hecho, a medida que las púas se reducían distalmente, el túbulo parecía volverse más propenso a retorcerse en comparación con las regiones proximales que podían doblarse en curvas suaves (Fig. 3g, flecha). Curiosamente, en imágenes en vivo de un hilo que se alarga, observamos que el túbulo realizó giros suaves de 180 ° en su región proximal densa de púas (Película complementaria 10). En conjunto, nuestros datos indican que la eversión del túbulo implica el despliegue de la pared del túbulo en la que las púas probablemente brindan soporte estructural para el hilo que se alarga.

Estos hallazgos nos permitieron construir un modelo que describe los aspectos clave de la eversión geométrica observada en tres fases. Nuestros resultados sugieren que los filamentos del eje están unidos apicalmente a las aletas de la cápsula y basalmente al túbulo a través de regiones conectoras (Fig. 4a). Fase I: Al momento de la descarga, el eje es expulsado junto con el conector cápsula-eje que cubre el eje de expulsión. Se forma una estructura de doble pared (Fig. 4b, c). Basado en imágenes fijas y películas, la eversión del eje ocurre después de la expulsión completa del eje. Por lo tanto, postulamos que el conector acumula la tensión elástica máxima cuando el eje expulsado alcanza su distancia máxima de la cápsula (Fig. 4c). Fase II: la tensión elástica en el conector cápsula-eje crea fuerzas hacia afuera aplicadas al ápice de los filamentos del eje comprimidos, lo que da como resultado el desprendimiento de los filamentos y el inicio del proceso de eversión debido a la liberación de la tensión elástica dentro del eje (Fig. 4d– g, iniciación). Al completar la secuencia, se forma un lumen dentro del eje que está protegido por los filamentos gruesos (Fig. 4h, final de la Fase II). Fase III: La fase final comienza con la liberación del conector eje-túbulo que se evierte plegándose sobre sí mismo formando una estructura de doble pared (Fig. 4i). El segmento no evertido del túbulo luego sale progresivamente de la cápsula y se mueve a través de la porción evertida del hilo de elongación (Fig. 4j).

El recuadro indica las subestructuras del nematocisto. Paneles inferiores: vistas ampliadas de regiones críticas durante distintas fases. Cápsula no descargada con eje fuertemente enrollado rodeado por la pared del eje, dos conectores y el túbulo enrollado. b, c Etapa inicial de descarga del pozo (Fase I). Se muestra el movimiento hacia adelante y la eversión del conector cápsula-eje (CS) que encierra los filamentos del eje expulsados. Las flechas indican el movimiento de avance del eje. d-h El mecanismo de eversión geométrica del eje y desenrollado de los filamentos comprimidos del eje (Fase II). Las flechas indican la dirección de las fuerzas aplicadas al vértice de los filamentos del eje comprimido. e–g Pasos en la progresión de la eversión del eje. El modelo muestra los filamentos del eje que se desenrollan y el movimiento hacia adelante del conector del eje-túbulo y el túbulo. h La etapa final de la eversión del eje. Nota: El extremo basal de la diáfisis no evertida se convierte en el extremo apical de la diáfisis evertida. i–j El mecanismo de eversión del conector eje-túbulo y el túbulo (Fase 3).

En este artículo, describimos la organización 3D del nematocisto y la secuencia de transformaciones geométricas que ocurren tras su activación. También sugerimos un modelo que explica los mecanismos específicos de la eversión del hilo. Con base en nuestros resultados, concluimos que la operación del nematocisto ocurre en tres etapas que involucran una transformación compleja del eje y el alargamiento del túbulo, durante el cual la energía almacenada en la estructura general se transforma en energía cinética. El eje realiza dos funciones críticas: primero como una jeringa comprimida para penetrar la cutícula objetivo; segundo como túnel protector para el paso del túbulo delgado.

La estructura del eje de los nematocistos antozoarios exhibe una estructura lamelar escalonada que difiere de las estenotelas especializadas de Hydra que exhiben un estilete colocado en forma de punta de flecha3,17,56,57. Godknecht y Tardent sugirieron previamente que la disposición escalonada de las láminas, como se ve en los ejes de los nematocistos de Anemonia sulcata, da como resultado un impacto "similar a un martillo perforador" en una pequeña área del objetivo durante la eversión17. En las estenotelas de Hydra, la punta del estilete impacta y perfora el objetivo en un solo punto2,3,11. Por lo tanto, la cinética de descarga en las estenotelas de Hydra es mucho más rápida que el proceso más lento de eversión del eje que observamos en los nematocistos de Nematostella11,12.

El proceso de eversión del eje se asemeja a la mecánica de una honda en forma de Y en la que la energía elástica se almacena en dos bandas unidas a una almohadilla que contiene un proyectil. Al soltar la almohadilla, las bandas estiradas experimentan una eversión geométrica. La energía elástica almacenada en las bandas se convierte en energía cinética del proyectil acelerado. Los nematocistos utilizan un enfoque similar, pero debido al espacio limitado dentro de la cápsula, almacenan la energía elástica requerida para la eversión del eje al doblar y torcer tres filamentos y unirlos a la cápsula y al túbulo. Las hélices de los filamentos evertidos exhiben un mayor radio y paso en comparación con su configuración no evertida. Por tanto, la cantidad de energía elástica almacenada en las bobinas helicoidales disminuye en el estado evertido. El exceso de energía liberado durante la eversión del eje posiblemente se use para la liberación del conector del túbulo del eje (Nota complementaria 1, Figura complementaria 7). Los conectores podrían funcionar en el inicio de la eversión; el estiramiento del conector cápsula-eje utiliza la energía de la descarga para iniciar la eversión del eje, mientras que el conector eje-túbulo transfiere la energía elástica de la "honda" para iniciar la eversión del túbulo. El conector túbulo eje suelto forma rápidamente un tubo cilíndrico que podría actuar como una zona de amortiguamiento para la transición del eje de tres filamentos al túbulo torcido.

La fuente de la fuerza impulsora para la penetración de los túbulos podría explicarse por la presión osmótica y las fuerzas elásticas acumuladas en la estructura de los túbulos. Se ha demostrado que la hidratación de las cápsulas rotas da como resultado la extrusión y el desenrollamiento del túbulo sin sufrir eversión, lo que sugiere que el túbulo torcido almacena energía elástica para luego transferirla a energía cinética al actuar como un resorte que se libera por relajación a un estado cilíndrico19 ,20. La estructura de doble pared que se ve después de la relajación (Fig. 3d, segundo panel, flecha) probablemente permite el flujo de matriz de PG desde la cápsula hacia la luz, recargando las fuerzas que empujan el túbulo hacia adelante20. El proceso se repite hasta que el túbulo se elonga por completo o llega a un obstáculo (Películas complementarias 10, 11). En resumen, este estudio demuestra la capacidad operativa del nematocisto como una micromáquina biológica compleja y autoensamblada. Proponemos que estos orgánulos antiguos y sofisticados representen un modelo ideal para dispositivos de microescala inspirados en la biología que podrían utilizarse en diversas aplicaciones que van desde la tecnología médica hasta la ciencia de los materiales.

Los animales se criaron a 23 °C en 12 partes por mil (ppt) de agua de mar artificial (ASW; Sea Salt; Instant Ocean). La inducción al desove y el des-gelatinizado se llevaron a cabo como se describió anteriormente58. Los embriones y los pólipos se cultivaron a temperatura ambiente de 23 °C o 25 °C.

La línea informadora transgénica se generó mediante la inserción mediada por meganucleasa de un plásmido que contenía EGFP bajo el control de un promotor de nematogalectina de N. vectensis específico de nematocitos59,60. Esta construcción se generó como parte de un sistema informador dual que alberga un informador neuronal mScarlet-I que no se analizó aquí y se describirá en una próxima publicación.

Se permitió que las planulae vivas de Nematostella vectensis (2 dpf) reaccionaran con el derivado de rodamina reactivo con amina 5/6-tetrametil-rodamina-6-isotiocianato, TRITC (Cayman Chemical, No. 19593) durante un breve período (30 min–1 h) . Los animales se incubaron durante 1 h a una concentración final de 1 μM para obtener imágenes en vivo de la descarga. Para muestras fijas, se incuba TRITC a una concentración final de 25 μM durante 1 hora con larvas de 2dpf. El tinte fluorescente tiñó a los animales sin ninguna toxicidad aparente hasta una concentración de 25 μM probada en este estudio. Tras la incubación, el colorante reactivo se eliminó mediante múltiples lavados. Los animales se transfirieron a platos limpios en un medio sin colorante durante 3 a 5 días hasta que surgieron nematocitos maduros y la fluorescencia de fondo no específica desapareció sustancialmente. Se prepararon soluciones madre de TRITC 25 mM y se almacenaron congeladas a -20 °C y se usaron sin una reducción observable en la reactividad química.

Para microscopía electrónica de barrido (SEM) de topografía (Fig. 3a), las muestras fueron procesadas de acuerdo con reportes previos61. Brevemente, las muestras se fijaron en glutaraldehído al 2,5 % y paraformaldehído al 2 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M y se tiñeron con ácido tánico acuoso, tetróxido de osmio, tiocarbodrazida y luego tetróxido de osmio nuevamente (TOTO). Las muestras se deshidrataron en una serie graduada de etanol y se secaron en el punto crítico en un secador de punto crítico Tousimis Samdri 795, se montaron en trozos y se tomaron imágenes en un SEM de sobremesa Hitachi TM4000 a 15 kV con detector BSE. Para microscopía electrónica (EM) de la ultraestructura interna, las muestras se fijaron como se indicó anteriormente, con fijación secundaria en tetróxido de osmio tamponado al 1 % durante 1 h y tinción en bloque en acetato de uranilo acuoso al 0,5 % durante la noche a 4 °C. Se utilizó una serie graduada de etanol para deshidratación con acetona como solvente de transición e infiltración en resina Hard Plus (Electron Microscopy Sciences). Las muestras se curaron durante 48 h a 60 °C y las secciones en serie se cortaron a 50 nm con una cuchilla de diamante ultra de 45 grados Diatome o una cuchilla de diamante de 35 grados AT-4 en un ultramicrótomo Leica UC7. Las secciones se recogieron en rejillas de ranura para imágenes STEM y un sustrato plano (cubreobjetos o chip de silicona) para imágenes SEM, y se tiñeron posteriormente con acetato de uranilo al 4 % en metanol al 70 % durante 4 min y tinción triple de plomo de Sato durante 5 minutos. Las secciones sobre sustrato plano se montaron en trozos, la parte inferior del cubreobjetos se pintó con pintura plateada para mitigar la carga y todas se recubrieron con carbono de 4 nm en un recubridor Leica ACE600. Se tomaron imágenes de las secciones en un Zeiss Merlin SEM utilizando el detector aSTEM o 4QBSD, SmartSEM (6.0.0, Zeiss) y el software Atlas 5.2.2.15 (Fibics, Inc.). Las imágenes en serie se alinearon y rastrearon para el modelado 3D en IMOD (4.9.10)62, y los modelos 3D se renderizaron en Blender 2.92 (Blender Foundation). El enderezamiento del nematocito completamente descargado (Fig. 2e) se realizó en Fiji (ImageJ)63. El compuesto de imagen de cápsula de nematocisto completo (Fig. 1d) y la coloración falsa se realizaron en Photoshop 2021 (Adobe, Inc.).

Los nematocistos de los animales tratados con TRITC se descargaron disminuyendo el pH del medio usando ácido acético. Los nematocistos se descargan in vivo cuando el medio se vuelve ácido. Los pólipos primarios se inmovilizaron en platos con fondo de vidrio intercalándolos entre un portaobjetos de vidrio y el fondo de un plato con fondo de vidrio usando sellador de silicona. Las imágenes capturadas después de la adición gota a gota de ácido acético glacial (37%) al ASW que desencadena la descarga de la cápsula cuando el pH disminuye lo suficiente en el medio por debajo de un cierto umbral. Las imágenes en vivo de la maduración del nematocisto y los eventos de descarga se registraron con el sistema de disco giratorio Yokogawa CSU-w1 en una plataforma Nikon Ti2 con un objetivo de 100x.

Los pólipos primarios tratados con TRITC se fijaron en fijador de Lavdovski (etanol∶formaldehído∶ácido acético∶dH2O; 50∶10∶4∶36) durante la noche24. Se eliminó el fijador y las muestras se lavaron 5 veces con 1 ml de PBS pH 7,4 para eliminar el fijador. Las muestras se permeabilizaron con Triton-X100 al 0,1 % en PBS, pH 7,4 durante 15 min. Después de varios lavados adicionales en PBST (Tween 20 al 0,1 % en PBS, pH 7,4), los pólipos se bloquearon primero durante 1 h y se incubaron durante la noche a 4 °C con NvNCol-4 (1:500) en PBST complementado con 10 % de cabra. suero. Minicolágeno y Ncol424 El anticuerpo anti-NvNcol-4 producido contra la proteína NvNcol-4 del minicolágeno de Nematostella vectensis (conejo, dilución 1:500) fue un amable obsequio de Suat Ozbek, Universidad de Heidelberg). Los pólipos se lavaron tres veces en PBST suplementado con suero de cabra al 10 % y se incubaron con anticuerpo secundario anti-conejo acoplado Alexa Fluor 647 (IgG anti-conejo de cabra (H + L), dilución 1:500, Thermo Fisher, Cat. #: A21245, Lote: 1981173) y WGA-OregonGreen (dilución 1:500, Invitrogen Cat. #: W7024B, Lote: 2298084) durante la noche en PBST complementado con suero de cabra al 10 %. Posteriormente, los pólipos se lavaron varias veces en PBS y se incubaron en PBS al 90 %/glicerol durante la noche. Los pólipos se transfirieron a un portaobjetos de vidrio y se montaron en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje antidecoloración ProLong Glass (ThermoFisher, Cat. #: P36982). Las imágenes de fluorescencia se adquirieron usando Yokogawa CSU-w1 en una plataforma Nikon Ti2. Las imágenes confocales de fluorescencia de superresolución se adquirieron utilizando el Zeiss LSM780 en modo Airyscan.

En la Fig. 2f, los pólipos primarios tratados con TRITC se fijaron en fijador de Lavdovski (etanol∶formaldehído∶ácido acético∶dH2O; 50∶10∶4∶36) durante la noche24,25. Después de varios lavados, los pólipos se transfirieron a PBS/Glicerol (PBS) y se incubaron durante la noche. Los pólipos se transfirieron a un portaobjetos de vidrio y se montaron con ProLong Glass Antifade Mountant (ThermoFisher, Cat. #: P36982). Los pólipos se extendieron sobre los portaobjetos de vidrio. Se tomaron imágenes de los tentáculos marcados con nematocistos parcialmente descargados intactos o aplastados con el portaobjetos para separar las cápsulas del tejido. La imagen de fluorescencia se realizó utilizando el Zeiss LSM780 en modo Airyscan.

Los pólipos primarios tratados con TRITC se congelaron en nitrógeno líquido, se descongelaron y se maceraron manualmente con un mortero de plástico. Las muestras se suspendieron en 1 ml de Percoll (50%, v/v; Sigma Cat. #: P1644) en sacarosa 300 mM suplementada con Tween20 al 0,01% para evitar la adhesión a los tubos de microcentrífuga. El tejido se rompe aún más pipeteando hacia arriba y hacia abajo. La mezcla se deja reposar en hielo durante 30 min y se centrifuga durante 15 min a 950 g. El sedimento se lava dos veces con PBS con Tween-20 al 0,01 %) resuspendido en tampón de descarga de nematocistos (Tris 10 mM, pH 7,5, CaCl2 10 mM). La descarga se inició mediante la adición de DTT 1 mM y se incubó durante 30 min. Tras la incubación durante 30 min, se añadió al tubo 1 μg/ml de aglutinina de germen de trigo conjugada con OregonGreen (dilución 1:500, Invitrogen, nº de catálogo W7024B, lote: 2298084) y se incubó durante 1 h. Las muestras teñidas se lavaron dos veces con PBST y se centrifugaron a 1000 × g durante 5 min. Se ve un sedimento suelto y se suspende en PBST. Se extendieron alícuotas de 5 μl sobre portaobjetos de vidrio y se montaron con ProLong Glass Antifade Mountant. Las imágenes se adquirieron utilizando el sistema de disco giratorio Yokogawa CSU-W1 en una plataforma Nikon Ti2 con un objetivo de 100x.

El ARN de horquilla corta dirigido a los genes putativos de Nematostella v1g243188 y Nemve1_232014 se sintetizó mediante la reacción de la polimerasa T7, se purificó con el kit Direct-zol RNA miniprep Plus (Zymo Research, Cat. #: R2072). El shARN purificado se microinyectó en óvulos no fertilizados a una concentración de 1 μg/μl o se sometió a electroporación a una concentración de ~600 ng/μl a 1 μg/μl de acuerdo con los métodos descritos anteriormente53,54. Los óvulos fueron fertilizados con esperma de machos transgénicos o de tipo salvaje. Después de la fertilización, los embriones se incubaron durante 2 días y se trataron con TRITC. Los siguientes cebadores (Integrated DNA Technologies) se recocieron y utilizaron como plantillas dúplex para la síntesis de ARN de horquilla corta:

v1g243188 Reenviar: TAATACGACTCACTATAGCGGTGGACTCTACTTATTTTCAAGAGAAATAAGTAGAGTCCACCGCTT y

v1g243188 Inverso: AAGCGGTGGACTCTACTTATTTCTCTTGAAAATAAGTAGAGTCCACCGCTATAGTGAGTCGTATTA

Nemve1_232014 Adelante:

TAATACGACTCACTATAGGCATCGTTACCAGTACAATTCAAGAGATTGTACTGGTAACGATGCCTT

Nemve1_232014 Inversa:

AAGGCATCGTTACCAGTACAATCTCTTGAATTGTACTGGTAACGATGCCCTATAGTGAGTCGTATTA

Correr hacia adelante:

TAATACGACTCACTATAGCAACACGCAGAGTCGTAATTCAAGAGATTACGACTCTGCTGTGTTGCTT

Revolver al revés:

AAGCAACACGCAGAGTCGTAATCTCTTGAATTACGACTCTGCGTGTTGCTATAGTGAGTCGTATTA.

Los animales sometidos a electroporación se disolvieron en reactivo TRIzol (Ambion, Ref: 15596018; lote n.° 254707 y el ARN se extrajo con el kit Direct-zol RNA Mini Prep Plus (Zymo Research, n.° de catálogo: R2072) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de la extracción del ARN , cDNA se sintetizó con el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Cat. #: 4382406, Lot # 0124432). Finalmente, qRT-PCR se llevó a cabo usando Luna Universal qPCR master mix (NEB, Cat. #: M3003L , n.º de lote: 10133023) utilizando los siguientes cebadores (Integrated DNA Technologies):

GAPDH

Adelante 5′-GGACCAAGTGCCAAGAACTG-3′

Inversa 5′-GGAATGCCATACCCGTCAG-3′

v1g243188

Adelante 5′-CCGCCTTATCCTTCGTTGAT-3′

5′-ATGCGGGTGGACTCTACTTATTG inverso

Nemve1_232014

Adelante 5′-TGTGAAGGAACGACGATGTG-3′

Inversa 5′-GACCGTTGATGACCTCGATAC-

Los datos cuantitativos de RT-PCR se analizaron como se describió anteriormente64.

Todo el análisis de imágenes se realizó con Fiji (ImageJ, 2.1.0/1.53c). El brillo, el contraste y la gamma se ajustaron manualmente. El fondo se restó usando la herramienta de restar fondo en Fiji. En la figura complementaria 6b, c, se aumentó el brillo para visualizar mejor la estructura del hilo. Las mediciones de longitud de las cápsulas y túbulos sin descargar y descargados se realizaron manualmente con la herramienta de rastreo manual a mano alzada de Fiji (ImageJ) y los resultados se analizaron en Información complementaria. La intensidad media de la señal, el área y la longitud de los objetos se adquirieron en Fiji (ImageJ) mediante el uso de una herramienta de medición. Los resultados se utilizaron en las estimaciones descritas en la información complementaria. Las estimaciones se realizaron en Wolfram Mathematica (12.0). En la Fig. 4, el modelo fue creado en Blender (2.93).

Para las micrografías EM de las Figs. 1d, e y 2b-e, se adquirieron secciones seriadas de dos animales diferentes. A partir de 350 cápsulas observadas en los volúmenes de ambos animales, adquirimos imágenes de alta resolución de tres volúmenes completos de cápsulas sin descargar y dos volúmenes parciales de cápsulas sin descargar; un volumen completo de cápsula descargada en la Fase 1, dos volúmenes completos de cápsulas descargadas en la Fase 2 y tres volúmenes parciales y un volumen completo de cápsulas descargadas en la Fase 3.

Para la verificación de qRT-PCR de la eliminación del gen objetivo, se realizaron tres experimentos de eliminación independientes con ~ 200 pólipos por muestra. Cada muestra se analizó por triplicado. Se generaron gráficos y se realizaron análisis estadísticos utilizando GraphPad Prism (9.3.1). La significancia estadística se determinó usando una prueba t de Student no apareada de dos colas, los valores p se indican en las leyendas de las figuras. Se utilizó la d de Cohen para evaluar el tamaño del efecto para todos los análisis de la prueba t (diferencia de medias entre los grupos dividida por la desviación estándar agrupada).

Se adquirieron imágenes de fluorescencia representativas de nematocistos parcialmente descargados de los tentáculos de animales tratados con TRITC fijados con el reactivo de Lavdovski con resultados idénticos en 10 experimentos independientes de etiquetado y descarga. La Figura 1a es una imagen representativa de la expresión transgénica observada en animales de seis desoves independientes. En la Fig. 1b, el nematocito y su cápsula eran representativos de los nematocitos de la columna del cuerpo (n = 10 columnas del cuerpo del pólipo primario, 5 experimentos). En la Fig. 1c, las cápsulas eran imágenes fluorescentes representativas de gran aumento de basitrichs pequeños (n = 19) y grandes (n = 20) y p-mastigophores (n = 10) purificados de ~ 200 pólipos primarios. La secuencia de imágenes en la Fig. 2a y los videos complementarios 5–7, 10 y 11 se grabaron a partir de tres experimentos de descarga en vivo independientes.

La figura 2f y la figura complementaria 2 eran imágenes representativas de súper resolución del eje y el túbulo de hilos parcialmente descargados de cuatro experimentos independientes. En la Fig. 2g y h, la secuencia de descarga se reconstruyó a partir de imágenes representativas de hilos parcialmente descargados (n = 67 hilos parcialmente descargados de tentáculos de pólipos primarios, tres experimentos). La Figura 3a es una imagen SEM representativa de hilos parcialmente descargados (n = 6). La figura 3b es una imagen representativa de tentáculos de pólipos primarios teñidos con WGA y TRITC fijados con el reactivo de Lavdovski (n = 10 tentáculos de pólipos primarios, tres experimentos). Las Figuras 3c, d eran representantes de los hilos de la Etapa 1 (Fig. 3c, n = 20) y los hilos de la Etapa 2 de doble pared (Fig. 3d, n = 8) entre los hilos visibles en un tentáculo de pólipo primario. Las Figuras 3e, f son imágenes fluorescentes representativas adquiridas de tentáculos de pólipos primarios parcialmente descargados de shRNA de control de codificación (n = 0/25 hilos de 1/27 tentáculos) y v1g243188 shRNA (n = 25/25 hilos de 1/25 tentáculos) de 5 experimentos de derribo. La Figura 3g era una imagen representativa de hilos purificados y completamente descargados de ~300 pólipos primarios (n = 15 hilos).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan con este documento. Se puede acceder a los datos originales subyacentes a este manuscrito desde el Repositorio de datos originales (ODR) de Stowers en: http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1684

Las solicitudes de correspondencia y materiales deben dirigirse a [email protected] Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Tardent, P. El cnidocito cnidario, un armamento celular de alta tecnología. BioEssays 17, 351–362 (1995).

Artículo Google Académico

Ozbek, S., Balasubramanian, PG & Holstein, TW Estructura del cnidoquiste y biomecánica de la descarga. Toxicón 54, 1038–1045 (2009).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Tardent, P. & Holstein, T. Morfología y morfodinámica del nematocisto estenotele de Hydra attenuata Pall. (Hidrozoos, Cnidaria). Res. de tejido celular. 224, 269–290 (1982).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Beckmann, A. & Ozbek, S. El nematocisto: un mapa molecular del orgánulo punzante cnidario. En t. J. Dev. Biol. 56, 577–582 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tardent, P. La biología de los nematocistos 309–332 (Academic Press, San Diego, CA, 1988).

Watson, GM & Hessinger, DA Los mecanorreceptores de cnidocitos están sintonizados con los movimientos de las presas nadadoras mediante quimiorreceptores. Ciencia 243, 1589–1591 (1989).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Lotan, A., Fishman, L., Loya, Y. & Zlotkin, E. Entrega de una toxina de nematocisto. Naturaleza 375, 456 (1995).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Lotan, A., Fishman, L. y Zlotkin, E. Compartimentación y administración de toxinas en Cnidaria: el túbulo del nematocisto como una flecha venenosa de múltiples puntas. Exp. J. Zool. 275, 444–451 (1996).

3.0.CO;2-O" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-010X%2819960815%29275%3A6%3C444%3A%3AAID-JEZ6%3E3.0.CO%3B2-O" aria-label="Article reference 8" data-doi="10.1002/(SICI)1097-010X(19960815)275:63.0.CO;2-O">Artículo CAS PubMed Google Académico

Kass-Simon, G. La fisiología del comportamiento y el desarrollo de los nematocistos. Poder. J. Zool.-Rev. Canadiense De. Zoología - Can. J. Zool. 80, 1772-1794 (2002).

Artículo Google Académico

Morán, Y. et al. El análisis del contenido de proteínas solubles de los nematocistos de una anémona de mar modelo arroja luz sobre la evolución del veneno. Mar. Biotecnología. 15, 329–339 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Holstein, T. & Tardent, P. Un análisis de exocitosis de ultra alta velocidad: descarga de nematocistos. Ciencia 223, 830–833 (1984).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Nuchter, T., Benoit, M., Engel, U., Ozbek, S. y Holstein, TW Cinética a escala de nanosegundos de la descarga de nematocistos. actual Biol. 16, R316–318 (2006).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Sakes, A. et al. Mecanismos de disparo en la naturaleza: una revisión sistemática. PLoS One 11, e0158277 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Gavelis, GS et al. Carrera armamentista microbiana: los "nematocistos" balísticos en los dinoflagelados representan un nuevo extremo en la complejidad de los orgánulos. ciencia Adv. 3, e1602552 (2017).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weber, J. Los poli(ácidos gamma-glutámicos) son los componentes principales de los nematocistos en Hydra (Hydrozoa, Cnidaria). J. Biol. química 265, 9664–9669 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Weber, J. Un nuevo tipo de polianiones como componentes principales de los nematocistos cnidarios. compensación Bioquímica Fisiol. Parte A: Fisiol. 98, 285–291 (1991).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Godknecht, A. & Tardent, P. Descarga y modo de acción de los nematocistos tentaculares de Anemonia sulcata (Anthozoa: Cnidaria). Mar Biol. 100, 83–92 (1988).

Artículo Google Académico

Beckmann, A. et al. Un elastómero similar a la seda que retrocede rápidamente facilita la descarga de nematocistos en nanosegundos. BMC Biol. 13, 3 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Carre, D. Hipótesis sobre el mecanismo de evaginación del filamento urticante de los cnidoquistes. EUR. J. Cell Biol. 20, 265–271 (1980).

CAS PubMed Google Académico

Parque, S. et al. La picadura del nematocisto es impulsada por el frente móvil del túbulo. JR Soc. Interfaz 14, 20160917 (2017).

Weill, R. Contribución al estudio de los cnidarios y sus nematocistos (Laboratorio para la Evolución de los Seres Organizados: Les Presses Universitaires de France, 1934).

Östman, C. Una guía para la nomenclatura y clasificación de nematocistos, y algunas notas sobre el valor sistemático de los nematocistos. ciencia 64 de marzo, 31–46 (2000).

Artículo Google Académico

Fautin, DG Diversidad estructural, sistemática y evolución de cnidae. Toxicón 54, 1054–1064 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zenkert, C., Takahashi, T., Diesner, MO & Ozbek, S. Análisis morfológico y molecular del nematostella vectensis cnidom. PLoS One 6, e22725 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Babonis, LS & Martindale, MQ Se requiere PaxA, pero no PaxC, para el desarrollo de cnidocitos en la anémona de mar Nematostella vectensis. Evodevo 8, 14 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Watson, GM & Mariscal, RN Ultraestructura de la descarga de nematocistos en los tentáculos de captura de la anémona de mar Haliplanella luciae (Cnidaria: Anthozoa). Célula de tejido 17, 199–213 (1985).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Reft, AJ, Westfall, JA & Fautin, DG Formación de los colgajos apicales en nematocistos de anémonas de mar (cnidaria: actiniaria). Biol. Toro. 217, 25–34 (2009).

Artículo PubMed Google Académico

Reft, AJ & Daly, M. Morfología, distribución y evolución de la estructura apical de los nematocistos en hexacoralia. J. Morphol. 273, 121–136 (2012).

Artículo PubMed Google Académico

Skaer, RJ & Picken, LE La estructura del hilo de nematocistos y la geometría de descarga en corynactis viridis allman. Filosofía Trans. R. Soc. largo Biol. ciencia 250, 131–164 (1965).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Hwang, JS et al. La nematogalectina, una proteína de nematocisto con dominios GlyXY y galectina, demuestra un empalme alternativo específico de nematocitos en Hydra. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 107, 18539–18544 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Watson, GM & Hessinger, DA Los cnidocitos y las células de soporte adyacentes forman complejos receptor-efector en tentáculos de anémona. Tissue Cell 21, 17–24 (1989).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Aerne, B., Stidwill, R. & Tardent, P. La descarga de nematocistos en Hydra no requiere la presencia de células nerviosas. Exp. J. Zool. - J. Exp Zool. 258, 137–141 (1991).

Artículo Google Académico

Westfall, JA, Landers, DD y McCallum, JD Diferentes nematocitos tienen diferentes sinapsis en la anémona de mar Aiptasia pallida (Cnidaria, Anthozoa). J. Morphol. 238, 53–62 (1998).

3.0.CO;2-O" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-4687%28199810%29238%3A1%3C53%3A%3AAID-JMOR4%3E3.0.CO%3B2-O" aria-label="Article reference 33" data-doi="10.1002/(SICI)1097-4687(199810)238:13.0.CO;2-O">Artículo PubMed Google Académico

Thorington, GU & Hessinger, DA Mecanismos eferentes de descarga de cnidae: II. Una respuesta de liberación de nematocistos en el tentáculo de la anémona de mar. Biol. Toro. 195, 145–155 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Weir, K., Dupre, C., van Giesen, L., Lee, AS y Bellono, NW Un filtro molecular para la respuesta a la picadura de los cnidarios. Elife 9, e57578 (2020).

Holstein, TW et al. Mini-colágenos fibrosos en nematocistos de hidra. Ciencia 265, 402–404 (1994).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Tursch, A., Mercadante, D., Tennigkeit, J., Grater, F. y Ozbek, S. Los dominios ricos en cisteína de Minicollagen codifican distintos modos de polimerización para formar cápsulas estables de nematocistos. ciencia Rep. 6, 25709 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ozbek, S., Engel, U. y Engel, J. Un cambio en el enlace disulfuro durante el ensamblaje de minicolágeno en nematocistos de hidra o cómo ensamblar una estructura resistente a 150 barras. J. Estructura. Biol. 137, 11–14 (2002).

Artículo PubMed CAS Google Académico

David, C. et al. Evolución de estructuras complejas: Los minicolágenos dan forma al nematocisto cnidario. Trends Genet.: TIG 24, 431–438 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Adamczyk, P. et al. Minicollagen-15, un nuevo minicolágeno aislado de Hydra, forma estructuras de túbulos en nematocistos. J. Mol. Biol. 376, 1008–1020 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sunagar, K. et al. El perfil de expresión específico del tipo de célula revela el desarrollo y la evolución de las células urticantes en la anémona de mar. BMC Biol. 16, 108 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Weber, J. Nuevas herramientas para el estudio del desarrollo, la migración y el recambio de nematocitos (células urticantes de cnidarios). J. ciencia celular. 108, 403–412 (1995).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Krohne, G. Organelle supervivencia en un organismo extraño: Hydra nematocistos en el platelminto Microstomum lineare. EUR. J. Cell Biol. 97, 289–299 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ozbek, S. et al. La glicoproteína NOWA y los minicolágenos son parte de un polímero unido por disulfuro que forma la pared del nematocisto cnidario. J. Biol. química 279, 52016–52023 (2004).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Yamada, S., Morimoto, H., Fujisawa, T. & Sugahara, K. Glycosaminoglycans in Hydra magnipapillata (Hydrozoa, Cnidaria): Demostración de condroitina en el nematocisto en desarrollo, el orgánulo de la picadura y caracterización estructural de los glicosaminoglicanos. Glicobiología 17, 886–894 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Adamczyk, P. et al. Una condroitina no sulfatada estabiliza la túbulación de la membrana en los orgánulos cnidarios. J. Biol. química 285, 25613–25623 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ozbek, S. El nematocisto cnidario: una matriz extracelular en miniatura dentro de una vesícula secretora. Protoplasma 248, 635–640 (2011).

Artículo PubMed Google Académico

Yamada, S., Sugahara, K. & Ozbek, S. Evolución de los glicosaminoglicanos: estudio bioquímico comparativo. Integración Comunicativa Biol. 4, 150–158 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Shpirer, E. et al. Diversidad y evolución de minicolágenos y nematogalectinas de mixozoos. BMC Evol. Biol. 14, 205 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Itakura, Y., Nakamura-Tsuruta, S., Kominami, J., Tateno, H. e Hirabayashi, J. Perfiles de unión a azúcar de lectinas de unión a quitina de la familia Hevein: un estudio completo. En t. J. Mol. ciencia 18, 1160 (2017).

Artículo PubMed Central CAS Google Académico

Koch, AW et al. Spinalin, una nueva proteína rica en glicina e histidina en las espinas de los nematocistos de Hydra. J. ciencia celular. 111, 1545–1554 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hellstern, S. et al. Análisis de estructura/función de la espinalina, una proteína de la columna vertebral de los nematocistos de hidra. FEBS J. 273, 3230–3237 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Él, S. et al. Un código Hox axial controla la segmentación del tejido y el patrón corporal en Nematostella vectensis. Ciencia 361, 1377–1380 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Karabulut, A., He, S., Chen, CY, McKinney, SA y Gibson, MC Electroporación de ARN de horquilla corta para la eliminación rápida y eficiente de genes en la anémona marina estrella, Nematostella vectensis. desarrollo Biol. 448, 7–15 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sebe-Pedros, A. et al. Diversidad y regulación de tipos de células cnidarias reveladas por RNA-Seq de una sola célula de organismo completo. Celda 173, 1520–1534 e1520 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Campbell, RD Estructura de los nematocistos de Hydra: Geometría de la conexión entre el extremo y el túbulo. Trans. Soy. Sociedad microscópica. 96, 149–152 (1977).

Artículo Google Académico

Reft, A. Comprensión de la morfología y distribución de los nematocistos en las anémonas de mar y sus parientes. Tesis de Doctorado (The Ohio State University, 2012).

Genikhovich, G. & Technau, U. Inducción del desove en la anémona de mar estrella Nematostella vectensis, fertilización in vitro de gametos y eliminación de cigotos. Harb de primavera fría. Protocolo 2009, prot5281 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, PR & Technau, U. Una línea informadora transgénica específica de músculo de la anémona de mar, Nematostella vectensis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 107, 104–108 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Renfer, E. & Technau, U. Generación asistida por meganucleasa de transgénicos estables en la anémona de mar Nematostella vectensis. Nat. Protocolo 12, 1844–1854 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jongebloed, WL, Stokroos, I., Van der Want, JJ y Kalicharan, D. Técnicas de fijación sin recubrimiento o redundancia del recubrimiento conductor, operación FE-SEM de bajo kV y SEM/TEM combinados de tejidos biológicos. J. Microsc. 193, 158–170 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kremer, JR, Mastronarde, DN & McIntosh, JR Visualización por computadora de datos de imágenes tridimensionales usando IMOD. J. Estructura. Biol. 116, 71–76 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Schindelin, J. et al. Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas. Nat. Métodos 9, 676–682 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sabin, KZ, Jiang, P., Gearhart, MD, Stewart, R. & Echeverri, K. AP-1(cFos/JunB)/miR-200a regulan la respuesta de células gliales pro-regenerativas durante la regeneración de la médula espinal del ajolote. común Biol. 2, 91 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

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Agradecemos a Alejandro Sánchez Alvarado, Jay Unruh, Kausik Si, Whitney Leach, Eric Hill y Subramanian Ramanathan por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito. Estamos en deuda con Molly Simmons por las ilustraciones del modelo. Nos gustaría agradecer a Xia Zhao y Morgan Harwood (Electron Microscopy Core) por la asistencia en los experimentos y al Stowers Reptiles and Aquatics Facility por el mantenimiento de los animales. Agradecemos a Suat Ozbek, Universidad de Heidelberg, por el anticuerpo minicolágeno Ncol4 ya Ruohan Zhong por su ayuda en la generación de animales transgénicos. El trabajo fue financiado por el Instituto Stowers de Investigación Médica.

Instituto Stowers de Investigación Médica, Kansas City, MO, EE. UU.

Ahmet Karabulut, Melania McClain, Boris Rubinstein, Keith Z. Sabin, Sean A. McKinney y Matthew C. Gibson

Departamento de Anatomía y Biología Celular, Facultad de Medicina de la Universidad de Kansas, Kansas City, KS, EE. UU.

Mateo C. Gibson

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AK y MCG conceptualizaron este estudio. AK, BR y MCG escribieron el manuscrito. AK, SMC, MMKZS y BR realizaron los experimentos y analizaron los datos.

Correspondencia a Ahmet Karabulut o Matthew C. Gibson.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Nicholas Money y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Karabulut, A., McClain, M., Rubinstein, B. et al. La arquitectura y el mecanismo operativo de un orgánulo punzante cnidario. Nat Comun 13, 3494 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31090-0

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Recibido: 29 Septiembre 2021

Aceptado: 02 junio 2022

Publicado: 17 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31090-0

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