Las superficies de proteínas fortuitamente compatibles prepararon el control alostérico en la fotoprotección de cianobacterias

May 20, 2023

Nature Ecology & Evolution volumen 7, páginas 756–767 (2023) Citar este artículo

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Las interacciones altamente específicas entre proteínas son un requisito previo fundamental para la vida, pero la forma en que evolucionan sigue siendo un problema sin resolver. En particular, las interacciones entre proteínas inicialmente no relacionadas requieren que evolucionen superficies coincidentes. No está claro si tales compatibilidades superficiales solo pueden construirse mediante la selección en pequeños pasos incrementales, o si también pueden surgir de manera fortuita. Aquí, utilizamos la filogenética molecular, la reconstrucción de secuencias ancestrales y la caracterización biofísica de proteínas resucitadas para rastrear la evolución de una interacción alostérica entre dos proteínas que actúan en el sistema de fotoprotección de las cianobacterias. Mostramos que esta interacción entre la proteína carotenoide naranja (OCP) y su regulador no relacionado, la proteína de recuperación de fluorescencia (FRP), evolucionó cuando las cianobacterias adquirieron horizontalmente un precursor de FRP. Los precursores de FRP ya podrían interactuar y regular la OCP incluso antes de que estas proteínas se encontraran por primera vez en una cianobacteria ancestral. La interacción OCP-FRP explota una antigua interfaz de dímero en OCP, que también es anterior al reclutamiento de FRP en el sistema de fotoprotección. Juntos, nuestro trabajo muestra cómo la evolución puede crear sistemas regulatorios complejos fácilmente a partir de componentes preexistentes.

Las interacciones alostéricas entre proteínas son una forma omnipresente de regulación bioquímica en la que el sitio activo de una proteína se ve afectado por la unión de otra proteína a un sitio distal1. Cómo evolucionan tales interacciones es un problema sin resolver en la bioquímica evolutiva. Requiere que ambas proteínas (el regulador y el objetivo) desarrollen una interfaz coincidente, así como algún mecanismo que traduzca la unión del regulador a un cambio en el sitio activo de la proteína objetivo. Si todos los residuos que participan en esta interfaz y el mecanismo de transmisión tienen que evolucionar de novo, construir tal interacción requeriría varias sustituciones en ambas proteínas. Debido a que es muy poco probable que las trayectorias genéticas largas que involucran varias sustituciones en múltiples proteínas se solucionen mediante una deriva genética aleatoria, generalmente se supone que las interacciones existentes se han construido en pasos mutacionales incrementales. Cada paso agregaría un solo residuo interactuante y sería conducido a la fijación por la selección natural que actúa directamente sobre una función asociada con la interacción2. Sin embargo, en algunos sistemas de proteínas, interfaces o vías alostéricas preexistían fortuitamente en uno de los dos socios3,4,5,6. Esto indica que algunos aspectos de estas interacciones surgieron por casualidad, que luego fueron aprovechados por otros componentes que surgieron más tarde.

No está claro hasta qué punto es necesaria la selección directa para dar forma a estos componentes restantes de una interacción, como la superficie de interacción de un nuevo regulador que explota una superficie preexistente en su objetivo. En principio, estas características también podrían ser completamente accidentales si inicialmente se arreglaron por razones no relacionadas con la interacción. En todos los casos bien estudiados, no podemos responder a esta pregunta porque ambos componentes se originaron dentro del mismo genoma donde el objetivo y el regulador siempre se habrían encontrado, por lo que la selección puede o no haber actuado para adaptar el regulador a su nuevo objetivo3, 4,5,6. Si alguna interacción biológicamente significativa alguna vez surgió realmente por casualidad, por lo tanto, sigue siendo desconocido.

Aquí abordamos este problema estudiando la evolución de una interacción alostérica en el sistema de fotoprotección de las cianobacterias7,8. Los organismos fotoactivos deben protegerse de la alta irradiación de luz que causa el fotodaño. En las cianobacterias, esta protección está mediada por la proteína carotenoide naranja (OCP)9,10, un sensor de intensidad de luz fotoactiva con un carotenoide incrustado simétricamente en sus dos dominios que puede cambiar la conformación de una naranja inactiva (OCPO) a una roja activada (OCPR) en condiciones de mucha luz11. El OCPR activado se une al complejo de antena captadora de luz de cianobacterias, el ficobilisoma, para disipar el exceso de excitación del ficobilisoma en forma de calor11,12. Dos parálogos de OCP (OCP2 y OCPx) pueden desprenderse del ficobilisoma y recuperarse pasivamente en OCPO en la oscuridad11,13. Sin embargo, el parálogo más común OCP1 se basa en una regulación alostérica para la foto-recuperación: OCP1 interactúa con la proteína de recuperación de fluorescencia (FRP), un pequeño regulador dimérico que termina la interacción con el ficobilisoma y acelera fuertemente la conversión inversa de OCPR. en el estado naranja de reposo14,15 (Fig. 1a). Aunque recientemente se ha demostrado la evolución probable de OCP a partir de precursores no fotoconmutables16, aún no se sabe cómo se reclutó FRP en el sistema de fotoprotección de cianobacterias como un nuevo regulador alostérico.

a, Mecanismo de fotoprotección mediada por OCP exclusiva de cianobacterias que implica el control alostérico por FRP (cian) en parálogos de OCP1. Estructuras utilizadas (ID de PDB): 7EXT (ref. 57), 3MG1 (ref. 58), 4JDX (ref. 25) y 7SC9 (ref. 29). PBS, ficosbilisoma. b, filogenia ML reducida de parálogos OCP con velocidad relativa de recuperación de la fotoconversión indicada, y proteínas ancestrales reconstruidas (Anc) de clados seleccionados. Los CTDH cianobacterianos son el grupo externo. Los números en negrita cuentan taxones de parálogos OCP designados. Los números en cursiva son probabilidades de arranque de Felsenstein de 100 repeticiones. Las longitudes de las ramas representan las sustituciones promedio por sitio. El árbol completo se muestra en Datos extendidos Fig. 1. c, espectros de absorción ultravioleta-visible del estado naranja inactivo y rojo activo de AncOCPall en comparación con OCP1 existente de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3; líneas discontinuas). d–f, recuperación de la fotoconversión de OCP ancestrales a 20 °C con (cian) o sin SYNY3 FRP (negro), y constantes de tiempo de recuperación media respectivas (τ) con sd de tres réplicas independientes: AncOCPall (d), AncOCP1&2 (e ) y AncOCP1 (f). Los conjuntos de datos representativos se muestran para mayor claridad.

Para rastrear los orígenes evolutivos de la interacción alostérica de OCP1 con FRP, primero buscamos comprender cómo evolucionaron los parálogos de OCP y cuándo adquirieron la capacidad de ser regulados por FRP. Recientemente se ha demostrado que el primer OCP probablemente evolucionó a través de un evento de fusión de genes de dos proteínas pequeñas y que la adición de un conector proporcionó fotoconmutación16. Los homólogos de estas proteínas de un solo dominio todavía se pueden encontrar en las cianobacterias existentes y se han denominado proteínas carotenoides helicoidales (HCP) y homólogos similares al dominio C-terminal (CTDH) que presentan un pliegue común de proteínas del factor de transporte nuclear 2 (NTF2)17 . Primero inferimos una filogenia de máxima verosimilitud (ML) de las proteínas OCP, utilizando secuencias CTDH de cianobacterias como el grupo externo para enraizar nuestro árbol (Fig. 1b y Datos extendidos Fig. 1). Describimos además un enraizamiento alternativo usando secuencias HCP en Datos extendidos Fig. 2. Nuestro árbol filogenético es prácticamente idéntico a un árbol16 publicado recientemente, con OCPx, OCP2 y OCP1 formando grupos monofiléticos bien respaldados. OCP1 y OCP2 son grupos hermanos, con exclusión de todos los demás OCP. Dos clados más no caracterizados se ramifican entre el grupo OCPx y OCP1 y OCP2, que podrían ser OCPx adicionales o representar parálogos separados.

Usamos la reconstrucción de la secuencia ancestral para inferir las secuencias de aminoácidos de los OCP ancestrales en los nodos internos de nuestro árbol y a lo largo del linaje hacia el OCP1 regulado por FRP. Nos enfocamos en tres proteínas desde el último ancestro común (LCA) de todos los OCP existentes (AncOCPall) hasta el LCA de parálogos de OCP1 y OCP2 (AncOCP1 y 2) hasta el LCA de OCP1 existente (AncOCP1), que se reconstruyeron con probabilidades posteriores promedio a través de sitios entre 0.92 y 0.96 (Fig. 1b y datos extendidos Fig. 3a-e). Resucitamos estas proteínas OCP ancestrales heterólogamente en Escherichia coli y las purificamos para la caracterización in vitro. Todos los OCP ancestrales son sensores de intensidad de luz fotoconmutables con una equinenona unida como carotenoide favorecido (Fig. 1c y Datos extendidos Fig. 4a-h). AncOCPall muestra una constante de tiempo moderada para la conversión inversa de OCPR a OCPO de 166 ± 10 s (similar al OCP2 existente, ref. 16). La constante de recuperación disminuye a 20 ± 1 s en AncOCP1 y 2 (más rápido que los OCP existentes), pero aumenta drásticamente en AncOCP1 a 314 ± 8 s (como en el OCP1 existente) (Fig. 1d–f y Datos extendidos Fig. 4i–l). Nuestros datos muestran que la fotorrecuperación lenta es una característica que evolucionó a lo largo de la rama hasta OCP1, de acuerdo con la teoría de que solo los parálogos de OCP1 requieren FRP para la recuperación alostéricamente acelerada.

A continuación, probamos el efecto de un FRP existente de Synechocystis sp. PCC 6803 sobre los tiempos de recuperación de nuestros OCP ancestrales. Los dos ancestros anteriores no se ven afectados por FRP, mientras que AncOCP1 solo puede recuperarse rápidamente en presencia de FRP (en proporciones molares de cinco OCP a un FRP), lo que acelera la conversión inversa de OCPR a OCPO en aproximadamente un 97% (similar a OCP1 existente) (Fig. 1d–f y datos extendidos Fig. 4m–t). Como AncOCP1&2 no se ve afectado por FRP, la aceleración alostérica de la recuperación de OCP evolucionó después del evento de duplicación de genes que dio lugar a parálogos de OCP1 y OCP2, solo a lo largo de la rama de OCP1.

Probamos la solidez de nuestras conclusiones a las incertidumbres estadísticas en nuestras secuencias resucitadas al resucitar adicionalmente una secuencia alternativa menos probable, pero estadísticamente plausible, por antepasado (ver Métodos para más detalles). Las caracterizaciones biofísicas de estas proteínas OCP ancestrales alternativas confirman que la recuperación y aceleración lentas por FRP evolucionaron a lo largo de la rama que conduce a OCP1 (datos extendidos Fig. 5a-l).

Luego preguntamos cuándo apareció FRP por primera vez en los genomas de cianobacterias, en relación con la duplicación de genes que produjo OCP1 regulado por FRP. Para responder a esto, inferimos una filogenia de especies ML de cepas de cianobacterias que contienen OCP que se encuentran en nuestro árbol OCP y mapeamos la presencia de parálogos de FRP y OCP en él (Datos extendidos Fig. 6). Prácticamente todos los genomas que contienen OCP1 también contienen FRP, lo que sugiere que FRP se obtuvo cerca de la duplicación que produjo OCP1. Es difícil decir exactamente en qué parte de la filogenia de la especie ocurrieron las sucesivas duplicaciones de OCP, porque los parálogos de OCP2 y OCPx tienen distribuciones muy esporádicas, y las relaciones dentro de cada clado de OCP están mal resueltas. Las gloeobacterias, que en nuestra filogenia18,19,20,21 y en otras especies son hermanas de todas las demás cianobacterias, solo poseen OCPx, mientras que los grupos que se ramifican inmediatamente después ya tienen OCP1 y FRP u OCP2 o ambos. Esto sugiere que la duplicación que produjo OCP1 y OCP2 ocurrió relativamente rápido después de que Gloeobacter spp. se separó de todas las demás cianobacterias, y ese FRP fue reclutado en el sistema casi al mismo tiempo.

Nuestro próximo objetivo era entender el origen de FRP. Los homólogos de FRP (denominados FRP-like, FRPL) también se pueden encontrar en bacterias lejanamente relacionadas8,22, principalmente proteobacterias y acidobacterias, lo que sugiere un origen mucho más allá de las cianobacterias. Para probar esta teoría, buscamos extensamente homólogos de FRP dentro y fuera de las cianobacterias e inferimos una filogenia ML. Nuestro árbol presenta una división altamente respaldada entre todos los FRP y todos los FRPL (Fig. 2a). Un pequeño grupo de FRPL delta-proteobacterianas se ramifica más cerca del grupo de FRP de cianobacterias con un alto apoyo estadístico (prueba de razón de verosimilitud aproximada (aLRT) = 60,9, expectativas de arranque de transferencia (TBE) de 0,99). Sin embargo, en algunas ejecuciones de arranque, los FRPL de otros taxones bacterianos con ramas terminales largas saltan a este grupo, lo que da como resultado un soporte de arranque deficiente de Felsenstein (FBP = 0.51), pero los FRPL delta-proteobacterianos siguen siendo hermanos de FRP en todos los análisis. Otros FRPL se distribuyen esporádicamente en las proteobacterias y acidobacterias, y se encuentran principalmente en especies no cultivadas (y completamente ausentes en organismos modelo). Dentro de diferentes grupos de proteobacterias, nuestro árbol se vuelve pobremente resuelto, probablemente debido a la corta longitud de las proteínas FRP y FRPL.

a, Filogenia ML reducida de FRP cianobacteriano (cian) y proteínas FRPL homólogas con las examinadas en este estudio indicadas por un círculo magenta y el nombre de su especie huésped. Los números en negrita cuentan taxones de grupos bacterianos colapsados. El número en cursiva indica TBE de 100 repeticiones. El árbol estaba enraizado entre proteobacterias y acidobacterias, e indica una HGT entre delta-proteobacterias y cianobacterias (línea roja). Las longitudes de las ramas representan las sustituciones promedio por sitio. El árbol completo se muestra en la figura complementaria 1. b, estructura cristalina del homodímero FRPL de P. borbori a 1,8 Å con dominios de cabeza indicados (PDB ID 8AG8) c, superposición rotada con FRP (PDB ID 4JDX de Synechocystis sp CCP 6803, ref. 25). rmsd, desviación de la raíz cuadrada media.

Enraizamos el árbol entre acidobacterias y proteobacterias dentro del grupo FRPL como la hipótesis de raíz más parsimoniosa. Esta raíz indica una transferencia génica horizontal (HGT) de una proteobacteria delta ancestral a una cianobacteria ancestral y, además, indica muchas pérdidas esporádicas de FRPL en acidobacterias y proteobacterias (Fig. 2a). Por el contrario, una raíz dentro del grupo FRP requeriría eventos HGT más y menos plausibles: al menos de cianobacterias a solo un pequeño conjunto de proteobacterias, luego a acidobacterias y luego de acidobacterias relativamente modernas a proteobacterias tempranas. Una raíz entre los FRP y los FRPL requeriría un origen de la proteína en el LCA de todas las bacterias23, lo que indicaría pérdidas en muchos grupos bacterianos grandes, así como la misma transferencia temporalmente inverosímil de las acidobacterias modernas al LCA de las proteobacterias (ver Discusión complementaria para detalles). Como consecuencia, nuestros resultados indican que lo más probable es que FRP haya sido adquirido horizontalmente por una cianobacteria ancestral al principio de la historia de las cianobacterias.

Para comprender el estado ancestral de las proteínas FRPL antes de que se transfirieran a las cianobacterias, expresamos, purificamos y caracterizamos heterólogamente el FRPL de una de las pocas bacterias mesófilas aisladas que presentan FRPL (PbFRPL): la gamma-proteobacterium Pseudomonas borbori, un pariente cercano de P. aeruginosa24. La espectroscopia de dicroísmo circular de PbFRPL mostró el pliegue alfa-helicoidal típico, encontrado previamente en FRP en solución, y la espectrometría de masas nativa confirmó el estado dimérico distintivo8,14 (Datos extendidos Fig. 7a-c). Resolvimos la estructura cristalina de PbFRPL a una resolución de 1,8 Å (Tabla 1). El dominio N-terminal consta de dos hélices alfa antiparalelas de aproximadamente 50 Å de longitud y presenta una interfaz de homodimerización similar a la de los FRP con una superficie enterrada estimada de alrededor de 675 Å2. El dominio de la cabeza C-terminal, que en FRP se cree que interactúa con OCP1 (refs. 25, 26, 27), también está presente en PbFRPL y constituye tres hélices alfa entrelazadas. En general, PbFRPL y FRP de Synechocystis sp. PCC 6803 (Banco de datos de proteínas (PDB) ID 4JDX, ref. 25) se superponen con una desviación cuadrática media de 2,08 Å (Fig. 2b, c). Las propiedades estructurales de PbFRPL son, por lo tanto, extremadamente similares a las del FRP cianobacteriano.

No está claro qué función llevan a cabo los FRPL, pero no puede regular la OCP porque los genomas que contienen FRPL no contienen OCP ni homólogos de su dominio N-terminal o proteínas similares a CTD (HCP y CTDH, respectivamente). En P. borbori, el gen frpl está codificado en su único cromosoma, y ​​no encontramos ningún homólogo de OCP, HCP o CTDH (Datos extendidos Fig. 7d). La microscopía de epifluorescencia de PbFRPL fusionada con un fluoróforo mVenus y expresada a partir de un plásmido bajo su promotor nativo en P. borbori mostró una distribución homogénea en toda la célula durante el crecimiento exponencial y una concentración adicional en los polos de la célula tras la inanición con aumento de células completas. fluorescencia integrada en aproximadamente 2,5 a 3,4 veces por encima del aumento de tipo salvaje (datos extendidos Fig. 7e-g). Teniendo en cuenta que no podemos controlar el número de copias de proteínas aquí, es notable que la localización y la cantidad de PbFRPL cambian en respuesta a la inanición. Nuestros datos indican que, a pesar de sus estructuras extremadamente similares, los FRPL llevan a cabo una función potencialmente relacionada con el estrés que debe ser totalmente ajena a los OCP y la regulación de la fotoprotección.

El pliegue compartido de FRPL y FRP sugiere que los FRPL pueden interactuar productivamente con OCP, lo que significa que es posible que no hayan necesitado modificaciones adicionales después de ser transferidos a las cianobacterias para funcionar inmediatamente en su sistema de fotoprotección. Para probar esto, purificamos varios FRPL de especies existentes y examinamos su efecto en la fotorrecuperación de OCP1 existente. Elegimos FRPL de cuatro organismos que abarcan la diversidad de grupos bacterianos que contienen FRPL en nuestro árbol filogenético: P. borbori, Methylocaldum sp. (otra gamma-proteobacteria), Chlorobi sp. (una especie del grupo FCB) y una delta-proteobacteria de la familia Desulfobacteraceae, que representa una de las secuencias existentes más cercanas al evento HGT en cianobacterias en nuestro árbol (Fig. 2a). FRPL de P. borbori, Methylocaldum sp. y Chlorobi sp. prácticamente no tuvo ningún efecto en la foto-recuperación de OCP1. Sin embargo, Desulfobacteraceae FRPL mostró la aceleración típica de la recuperación de OCP1 de la fotoconversión en aproximadamente un 93 % (cuando se incuba en una proporción equimolar de OCP1 a FRPL), en comparación con OCP1 solo (Fig. 3a,b y Datos extendidos Fig. 7h–k) . Esto indica que la capacidad de regular OCP1 ya existía en el momento del evento HGT que primero transfirió FRP a las cianobacterias. Para probar aún más esta teoría, también resucitamos dos proteínas ancestrales: FRPLpreHGT que es el último FRPL que podemos reconstruir antes del evento HGT y FRPpostHGT que representa el LCA de todo el FRP en cianobacterias después del HGT (Fig. 3c). Ambas proteínas ancestrales también muestran el típico efecto de aceleración de FRP en la foto-recuperación de OCP1, funcionando casi tan bien como el FRP existente (Fig. 3d, e y Datos extendidos Fig. 8a-d). Esta inferencia es aún más sólida para las proteínas ancestrales FRP y FRPL ancestrales alternativas con secuencias ligeramente diferentes que, sobre la base de una filogenia inicial de FRP (L), habíamos inferido anteriormente con menos secuencias en total (Datos extendidos Fig. 8e-j).

a,b, Recuperación de la fotoconversión de OCP1 existente de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) con FRPL existente de P. borbori (a) o una especie de Desulfobacteriaceae (Desulfo.) (b) en diferentes proporciones molares como se indica a 20 °C con constantes de tiempo de recuperación media respectivas (τ) y sd de tres independientes replica Los conjuntos de datos representativos se muestran para mayor claridad. ND, no determinable. c, Filogenia esquemática de FRP (L) con proteínas ancestrales reconstruidas y FRPL existentes probados. El árbol completo se muestra en la Fig. 1 complementaria. d, e, Recuperación de la fotoconversión de SYNY3 OCP1 existente con FRPL ancestral (FRPLpreHGT) que existía antes (d) y FRP ancestral (FRPpostHGT) que existía después del HGT (e) en diferentes relaciones molares como se indica a 20 °C con constantes de tiempo de recuperación media respectivas (τ) y sd de tres réplicas independientes. Los conjuntos de datos representativos se muestran para mayor claridad.

En conjunto, nuestros resultados muestran que la mayoría de los FRPL no pueden funcionar como reguladores alostéricos de OCP1, pero que un pequeño subgrupo de ellos adquirió esta capacidad de manera fortuita. Debido a que esto sucedió en un genoma que no contenía OCP, esta capacidad es completamente accidental y no puede haber sido el resultado de la selección natural directa. En principio, esto habría permitido que la proteína funcionara en el sistema de fotoprotección totalmente independiente de las cianobacterias en el momento en que se transfirió por primera vez a sus genomas.

Dado que algunos FRPL parecen estar preparados para la interacción con OCP incluso antes de que entraran en las cianobacterias, razonamos que la interfaz para su interacción también puede estar presente en AncOCPall, incluso si la conexión alostérica para acelerar la foto-recuperación aún no había evolucionado por completo. La cromatografía analítica de exclusión por tamaño (SEC) de formas rojas fotoactivadas de AncOCPall (AncOCPallR) incubadas con FRP existente mostró un tamaño aumentado en relación con AncOCPallR solo (Fig. 4a), lo que indica que FRP ya se une a AncOCPallR. Preguntamos si podíamos desencadenar la respuesta alostérica agregando FRP en exceso a la reacción de recuperación de OCPR a OCPO, y repetimos nuestros experimentos iniciales (Fig. 1d), pero esta vez usando una proporción molar mucho mayor de FRP en relación con OCP. Para nuestra sorpresa, en lugar de una aceleración, el tiempo de recuperación aumentó drásticamente de 166 ± 10 a 288 ± 10 s y 609 ± 5 s, usando una cantidad equimolar (de OCP a FRP) y un exceso molar de cinco veces de FRP, respectivamente (Fig. 4b). Esta desaceleración también apareció en AncOCP1 y 2, y si se agrega cualquiera de los FRP ancestrales o FRPL ancestrales (Fig. 4c y Datos extendidos Fig. 4u-x). Para descartar que esta ralentización solo se deba a efectos estéricos o aglomeración molecular, repetimos los experimentos con PbFRPL (que prácticamente no tiene ningún efecto sobre el tiempo de recuperación de OCP1, incluso si se agrega en exceso molar: Fig. 3a), y también encontramos virtualmente ningún efecto en la recuperación de AncOCPall (datos extendidos Fig. 4y).

a, SEC analítica de los complejos AncOCPall y AncOCPall-FRP con (OCPR) o sin iluminación de luz azul constante (OCPO) durante la cromatografía. b, c, Recuperación de la fotoconversión de AncOCPall con diferentes proporciones molares de FRP existente de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) (b) o FRPpostHGT (c) a 20 °C con las respectivas constantes de tiempo de recuperación promedio (τ) y sd de tres réplicas independientes. Los conjuntos de datos representativos se muestran para mayor claridad. Los datos para 'sin FRP' y '5:1 FRP' en b se toman de la Fig. 1d para comparación. d, modelo AlphaFold2 de la interacción entre FRP (cian) y el CTD de SYNY3 OCP1 (verde). e, Zoom girado (del área enmarcada en negro en d) en la interfaz de enlace, con AncOCPall (en trigo) superpuesto en OCP1. Los aminoácidos implicados en la unión están etiquetados. Los sitios conservados en ambos OCP están en negro. Nitrógeno en azul y oxígeno en rojo. Los números de residuos siguen SYNY3 OCP1. El inserto muestra el PP para los aminoácidos indicados en la interfaz de unión de la proteína AncOCPall reconstruida. f, PÁGINA nativa de OCPO ancestral sin iluminación (izquierda) y OCPR durante la iluminación de luz azul constante (derecha) muestran sus estados oligoméricos. La comparación con OCP1 (refs. 29, 58) indica interfaces de dimerización conservadas que difieren entre OCPO y OCPR. Se usaron como marcadores moleculares un mutante de OCP (70 kDa) y el CTD de OCP1 (29 kDa) que ambos forman dímeros independientes de la iluminación. Los experimentos fueron repetidos tres veces con resultados similares.

La unión de FRP por sí sola no es suficiente para que ocurra el efecto alostérico acelerador. En cambio, impide la foto-recuperación de AncOCPall con un alto exceso molar de FRP. La unión débil repetitiva o un FRP que no se disocia en la escala de tiempo correcta podría interrumpir o retrasar el proceso de recuperación de AncOCPall. Además, es posible que las características estructurales en el lado de OCP, como el bucle enlazador flexible entre el dominio N-terminal y CTD o la extensión corta de N-terminal, deban ajustarse aún más para que la respuesta alostérica compleja y altamente eficiente de OCP1 existente tome lugar16,26.

Nuestros experimentos muestran que el LCA de todos los OCP ya tenía una capacidad latente para interactuar con FRP, aunque esta interacción aún no era capaz de acelerar la recuperación. Esto implica que al menos este potencial de interacción entre OCP y FRP evolucionó por pura casualidad, incluso antes de que estas proteínas se encontraran por primera vez en una cianobacteria ancestral.

Para comprender la base estructural de esta afinidad latente, inferimos un modelo AlphaFold2 (ref. 28) del complejo OCP1-FRP. Predijo con confianza una interacción entre el CTD de OCP1 y FRP (Fig. 4d y Datos extendidos Fig. 9a, f) que es consistente con los datos previos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño27. La interacción explota la misma superficie hidrofóbica que usa OCP1 para dimerizarse en su estado rojo en el ficobilisoma29. Se ha teorizado que FRP favorece la separación de OCP1R del ficobilisoma al reducir la constante de asociación de unión y acelerar la recuperación al competir con esta interfaz de dímero en OCP1 (ref. 27). Los residuos y cargas que se muestran importantes para esta interfaz de dímero también están presentes en nuestros OCP ancestrales (Datos extendidos Fig. 3a), lo que podría explicar por qué FRP ya puede interactuar con AncOCPall. Probamos esta hipótesis de dos maneras: primero, inferimos un modelo AlphaFold2 del CTD de AncOCPall y comparamos sus superficies con el CTD de OCP1. AncOCPall posee la misma superficie hidrofóbica que OCP1 con prácticamente todos los sitios de interfaz o cargas idénticas entre las dos proteínas. AlphaFold2 también predice una interacción entre esta superficie en AncOCPall y FRP (Fig. 4e y Extended Data Fig. 9b–e,g). En segundo lugar, este modelo indica además que la dimerización en el estado rojo debería ser una característica ancestral de todos los OCP. Para probar esto, usamos Native PAGE para comprender si nuestros OCP ancestrales también se dimerizan en su forma roja activada. De acuerdo con nuestra predicción, la activación conduce a la formación de complejos de tamaño consistente con homodímeros en AncOCPallR y AncOCP1R. No detectamos dímeros rojos en AncOCP1 y 2, probablemente debido a su tiempo de recuperación extremadamente rápido que técnicamente impide mantener la forma roja en el gel (Fig. 4f).

En conjunto, esto indica que la superficie de unión explotada por FRP es una antigua interfaz de dímero de la forma roja de OCP que ya estaba presente en el LCA de todos los OCP, incluso antes de que FRP fuera reclutado en el sistema de cianobacterias.

Los parálogos de OCPx ya no se ven afectados por FRP16,30. Para identificar los cambios estructurales subyacentes entre AncOCPall y OCPx, repetimos las predicciones de interacción con el CTD de un OCPx existente de Gloeobacter kilaueensis JS1. AlphaFold2 no predijo la interfaz de interacción entre FRP y este OCPx a menos que cambiáramos una serina conservada en la interfaz potencial a la tirosina ancestral de AncOCPall (Datos extendidos Fig. 9h, i). Esto sugiere que las proteínas OCP entraban y salían del estado estructural que permite la interacción con FRP.

Para comprender las causas estructurales de por qué solo algunos FRPL aceleran la recuperación de OCP1 de la fotoconversión, finalmente comparamos las secuencias de diferentes FRPL. En nuestro modelo AlphaFold2, fenilalanina 76, lisina 102 y leucina 106 en FRP de Synechocystis sp. PCC 6803 están en contacto con OCP1. La mayoría de los FRPL no tienen los tres estados juntos, pero ocasionalmente tienen uno o dos de estos estados. P. borbori FRPL, por ejemplo, tiene la fenilalanina, pero presenta una tirosina en la posición 102 y una serina en la posición 106 (Datos extendidos Fig. 8a). Otros FRPL tienen lisina, pero carecen de fenilalanina o leucina. Esto muestra que los estados importantes para la interacción con OCP1 van y vienen individualmente a través de la filogenia FRPL. Los tres estados solo aparecieron juntos en los FRPL a lo largo del linaje hacia delta-proteobacteria y cianobacteria. Es notable que la HGT en cianobacterias ocurriera exactamente en esta estrecha ventana de compatibilidad total.

Aquí, hemos reconstruido la evolución de una interacción alostérica en el sistema de fotoprotección de las cianobacterias. Junto con el trabajo previo sobre la evolución inicial de OCP13,16, la imagen que surge es un ejemplo notable de retoques evolutivos:31 Lo más probable es que los OCP se crearan mediante un evento de fusión de genes que solo requería un conector flexible para crear una proteína fotoconmutable. de dos componentes no conmutables16. La adquisición horizontal de FRP luego introdujo un nuevo componente que podría acelerar alostéricamente la recuperación del estado fundamental en OCP1 sin ninguna modificación adicional. La creación del sistema OCP1-FRP completamente funcional solo requirió sustituciones en OCP que convirtieron una interacción inicialmente improductiva con el CTD en una que resulta en una aceleración de la foto-recuperación (Fig. 5). Debido a que no podemos cronometrar la adquisición de FRP con precisión en relación con nuestros antepasados ​​​​de OCP, no sabemos si estas sustituciones ocurrieron antes o después de que se adquiriera FRP. Si hubieran ocurrido antes, la interacción reguladora entre OCP1 y FRP habría sido completamente funcional en el momento en que FRP se adquirió horizontalmente. Otra función conocida de FRP es la facilitación del desprendimiento de OCP1 del ficobilisoma al cambiar la constante de equilibrio de unión de OCPR-ficobilisoma15. Aunque este aspecto no fue examinado en nuestro estudio, imaginamos que la unión competitiva de FRP a un dímero OCPR ancestral también podría facilitar el desprendimiento del ficobilisoma o al menos impedir la unión a él, generando en efecto un modo de regulación ancestral potencial que también podría haber sido funcional desde el momento en que FRP apareció por primera vez en las cianobacterias.

El primer OCP fotoconmutable que sufre un cambio conformacional de un estado naranja cerrado a un estado rojo abierto con alta irradiación de luz se formó en un evento de fusión de un HCP ancestral (AncHCP) y un homólogo similar a CTD ancestral (AncCTDH) mediante la adición de un enlazador16 . Una proteína similar a FRP (FRPL) se transfirió horizontalmente (HGT) al sistema cianobacteriano no relacionado después de que una interfaz de unión latente para los OCP ancestrales ya hubiera evolucionado por casualidad. FRP ahora explota la interfaz de dimerización CTD conservada de OCPR para acelerar fuertemente la recuperación de OCP1 de la fotoconversión. La estructura OCP que se usa aquí solo como ilustración es PDB ID 3MG1 (ref. 58).

Una pregunta que queda es ¿por qué se reclutó FRP en el sistema de fotoprotección de cianobacterias? Los OCP que existían antes de que se reclutara FRP podrían recuperarse rápidamente por sí mismos. ¿Por qué complicar este sistema funcional? Somos conscientes de dos beneficios adaptativos postulados: primero, la interacción OCP1-FRP puede ofrecer un control más sofisticado del uso de energía en regímenes de luz que cambian rápidamente en la célula cianobacteriana13. Los sistemas de fotoprotección mediados por OCP sin FRP solo pueden regularse en el nivel de las transcripciones de ARN mensajero, que actúan solo lentamente al regresar de condiciones de luz estresantes a normales, mientras que el control por FRP permite una regulación postraduccional potencialmente más rápida32. En segundo lugar, puede brindar una fotoprotección superior en condiciones de mucha luz: los parálogos OCP2 y OCPx se recuperan tan rápido que luchan por acumular de manera estable la forma roja a temperatura ambiente13. El estado rojo más estable de OCP1 puede ser útil cuando se necesitan grandes cantidades de OCPR activo, pero esta alta estabilidad puede ser a expensas de no poder recuperarse solo. En este escenario, el reclutamiento de FRP habría permitido la evolución de un mecanismo de fotoprotección más eficiente en última instancia. Sin embargo, la interacción también podría ser un ejemplo de complejidad no adaptativa que simplemente se volvió difícil de perder33: la adquisición de FRP pudo haber permitido que OCP1 'olvidara' cómo recuperarse de manera eficiente por sí solo. Una vez que hubiera perdido esta capacidad, FRP se habría vuelto esencial para la función completa de OCP1.

La compatibilidad específica de la FRPL de la especie Desulfobacteraceae con los OCP de cianobacterias es completamente accidental, porque esta proteína evolucionó en un genoma que no contiene OCP. Esto demuestra que las superficies de proteínas altamente complementarias pueden evolucionar completamente por casualidad, y que tales interacciones inicialmente accidentales pueden incorporarse a la biología de los organismos. Por lo tanto, nuestro trabajo plantea la posibilidad de que algunas o incluso muchas interacciones proteína-proteína se creen inicialmente sin la acción de la selección natural directa. De hecho, los organismos pueden ser bombardeados con interacciones virtualmente completamente formadas que se crean cuando la transferencia horizontal, los cambios en la localización celular o los patrones de expresión espaciotemporal unen proteínas con superficies compatibles fortuitamente. De este grupo, la selección natural luego purgaría los que son dañinos, arreglaría los que son útiles e ignoraría los que son inofensivos.

Para inferir el árbol filogenético de las proteínas OCP de cianobacterias, usamos el conjunto de datos OCP de Muzzopappa et al.16, y alineamos el perfil de las secuencias de aminoácidos correspondientes de los tres tipos de OCP descritos allí (OCP1, OCP2, OCPx), usando MUSCLE (v .3.8.31)34. Agregamos secuencias de proteínas homólogas similares a CTD de cianobacterias (CTDH) o HCP de cianobacterias como el grupo externo respectivo. Las alineaciones se corrigieron manualmente, los sitios correspondientes a inserciones específicas de linaje y las secuencias duplicadas se eliminaron. Las alineaciones completas se encuentran en los Datos complementarios 1. Usamos RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10)35 en el modo PROTGAMMAAUTO para identificar el modelo de evolución de aminoácidos que mejor se ajusta, que fue la matriz de sustitución Jones-Taylor-Thornton revisada (JTTDCMut )36 con frecuencias base empíricas y distribución gamma de la tasa de variación entre sitios. Usamos PhyML (v.3.1)37 con movimientos SPR para inferir dos filogenias ML con secuencias CTDH o HCP incluidas, y enraizamos los árboles entre cualquiera de esas secuencias y todas las secuencias OCP en nuestros árboles. Las dos filogenias muestran básicamente la misma topología, pero el grado A no asignado se ramifica primero en el árbol del grupo externo HCP (Datos extendidos, Fig. 2). Como las gloeobacterias, que se sabe que son cianobacterias de ramificación temprana18,19,20,21, solo presentan OCPx, pero no homólogos de OCP de los grados no asignados, utilizamos el árbol de grupo externo CTDH para análisis adicionales (datos extendidos, figura 1). La solidez de cada topología se probó ejecutando 100 arranques no paramétricos y, además, calculando estadísticas aLRT con PhyML. Las secuencias OCP ancestrales se reconstruyeron en el nodo interno en el árbol del grupo externo CTDH, como se indica en la Fig. 1b y en los datos extendidos de la Fig. 1, utilizando la reconstrucción marginal en el módulo CodeML de PAML (v.4.9)38 con el modelo de sustitución JTTDCMut y 16 categorías gamma. Las secuencias ancestrales fueron recortadas siguiendo reglas de parsimonia y contienen los estados con las probabilidades posteriores (PP) más altas en todos los sitios seleccionados. Los valores promedio de PP para todas las proteínas reconstruidas se encuentran en Datos extendidos Fig. 3b-e. Las secuencias alternativas 'altAll' para cada ancestro reconstruido comprenden el estado con el segundo PP más alto si ese estado tiene PP > 0.20, y el estado ML en caso contrario.

Para el árbol filogenético FRP (L) (Fig. 2a), reunimos secuencias de aminoácidos utilizando BLASTP39 en línea el 23 de febrero de 2022, y la secuencia de aminoácidos FRP de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) como consulta. Para encontrar específicamente secuencias de FRPL, excluimos las cianobacterias (taxid: 1117) y repetimos la búsqueda contra SYNY3 FRP y, posteriormente, contra P. borbori FRPL o buscamos explícitamente en grupos taxonómicos distintos de las cianobacterias. Además, agregamos secuencias metagenómicas del Global Microbial Gene Catalog (GMGC, v.1.0)40. Las secuencias se alinearon con MUSCLE (v.3.8.31). La alineación se corrigió manualmente, se eliminaron los sitios correspondientes a las inserciones específicas de linaje y las secuencias duplicadas. La alineación completa se encuentra en los Datos complementarios 1. Usamos RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10) en el modo PROTGAMMAAUTO usando el criterio de información de Akaike para identificar el modelo de evolución de aminoácidos que mejor se ajustaba, que era la matriz de sustitución de Le-Gascuel41 con frecuencias base fijas y distribución gamma de la tasa de variación entre sitios. Inferimos la filogenia de ML y probamos la solidez de la topología ejecutando 100 arranques no paramétricos. Los TBE se calcularon con la herramienta web BOOSTER42. Además, las estadísticas de aLRT se calcularon con PhyML (v.3.1). El árbol estaba enraizado entre acidobacterias y proteobacterias en el grupo FRPL y sugiere una HGT de una proteobacteria delta ancestral a una cianobacteria ancestral. El árbol completo se encuentra en la figura complementaria 1. Las secuencias de FRPL ancestral y FRP ancestral (FRPLpreHGT y FRPpostHGT, respectivamente) se reconstruyeron en los nodos internos del árbol utilizando la reconstrucción marginal en el módulo CodeML de PAML (v.4.9) con el Le- Modelo de matriz de sustitución de gascuel (LG) y 16 categorías gamma. Los espacios se asignaron usando parsimonia. Para los ancestros que resucitamos, elegimos el estado de aminoácido con el PP más alto en cada sitio. Los PP promedio para las proteínas reconstruidas se encuentran en Datos extendidos Fig. 8b,c.

Para la reconciliación del árbol de genes y el árbol de especies, identificamos todas las secuencias en nuestro árbol FRP(L) que sin duda podrían asignarse a una cepa bacteriana distinta que también está depositada en la Base de datos de taxonomía del genoma (GTDB)43 con su conjunto de 120 copias únicas secuencias de proteínas marcadoras, utilizando BLASTP39. Con estas secuencias de aminoácidos concatenadas y alineadas, inferimos un árbol filogenético de ML usando IQ-Tree 2 (v.2.2)44 (-m LG, -b 100, -alrt 1000) y enraizado con acidobacteria como se describe anteriormente. En consecuencia, inferimos un árbol de genes con secuencias de FRP y FRPL de las especies correspondientes, y ejecutamos 100 arranques no paramétricos para este subconjunto. La conciliación se realizó utilizando la estimación ML con ALEml_undated en ALE45 y la filogenia de la especie enraizada, así como los árboles de arranque FRP (L) como entrada. Los árboles reconciliados y la salida ALE se depositan en los datos de origen.

Para reconstruir las secuencias ancestrales alternativas de FRPL y FRP ancestrales (altFRPLpreHGT y altFRPpostHGT, respectivamente), utilizamos una alineación inicial con menos secuencias en total. La alineación completa se encuentra en los Datos complementarios 1. Se infirió un árbol filogenético de ML con 100 arranques no paramétricos, y las secuencias ancestrales alternativas de FRPL y FRP ancestral se reconstruyeron en consecuencia en el nodo interno de ese árbol, que se muestra en Datos extendidos Fig. 8e y la Fig. 2 complementaria, utilizando la reconstrucción marginal en el módulo CodeML de PAML (v.4.9) con el modelo de sustitución de matriz de sustitución de Le-Gascuel y 16 categorías gamma. Los TBE se calcularon con la herramienta web BOOSTER. Las secuencias ancestrales alternativas se recortaron siguiendo reglas de parsimonia y contienen los estados con el PP más alto en todos los lados seleccionados. Los PP promedio para las proteínas reconstruidas se encuentran en Datos extendidos Fig. 8f, g.

Para el árbol de especies filogenéticas de cianobacterias que contienen OCP, identificamos todas las secuencias en nuestro árbol OCP que ciertamente podrían asignarse a una cepa de cianobacterias distinta que también está depositada en GTDB con su conjunto de 120 secuencias de proteínas marcadoras de una sola copia. Como grupo externo, agregamos conjuntos de secuencias de malainabacterias estrechamente relacionadas, así como conjuntos de especies de Chloroflexota relacionadas más distantemente. Usamos estas secuencias de aminoácidos concatenadas, las alineamos e inferimos un árbol filogenético usando RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10) en el modo PROTGAMMAAUTO, usando el criterio de información de Akaike para identificar el mejor modelo de evolución de aminoácidos, que fue la matriz de sustitución de Le-Gascuel41 con frecuencias base empíricas y distribución gamma de la tasa de variación entre sitios. Inferimos la filogenia de ML y probamos la solidez de la topología ejecutando 100 arranques no paramétricos. Enraizamos el árbol entre las cianobacterias y el grupo externo, y mapeamos la apariencia de los genes frp y ocp en los genomas correspondientes, sobre la base de los aciertos de BLASTP y tBLASTn39, junto al árbol (Datos extendidos Fig. 6). La asignación de secuencias OCP particulares a un grupo parálogo de OCP se basa en la posición de sus secuencias de aminoácidos traducidas en nuestro árbol OCP (Datos extendidos Fig. 1).

Secuencias de ADN de OCP ancestrales, OCP1 existente de Synechocystis sp. Se optimizaron los codones de PCC 6803 (SYNY3) y FRP (SYNY3) para la expresión en E. coli y se sintetizaron mediante Genscript Biotech o Life Technologies (GeneArt). Las construcciones sintetizadas estaban flanqueadas por sitios de escisión BamHI y NotI para la clonación en un vector pRSFDuet-1 modificado (Merck Millipore), que codifica un sitio de escisión de proteasa 3 C de rinovirus humano (HRV) específico (LEVLFQ/GP) y una etiqueta 6xHis en el N terminal (plásmido resultante denominado pRSFDuetM). Después de la escisión, todas las construcciones comenzaron con GPDPATM. Para la expresión de FRP existente (gen SYNY3 slr1964), el vector pRSFDuetM-FRP se transformó en E. coli BL21 (DE3) (New England Biolabs), que se cultivaron durante la noche a 37 °C en medio Luria-Bertani (LB) (1 % triptona, 1% NaCl, 0,5% extracto de levadura, pH 7,0), suplementado con kanamicina (Kan, 50 µg ml−1). Al día siguiente, se inoculó 1 l de LB + Kan con 10 ml de cultivo durante la noche y se incubó a 37 °C hasta una densidad óptica (OD600nm) de 0,6–0,8, luego se indujo con isopropil-β-d-tiogalactopiranósido 0,5 mM ( IPTG) y crecido en una incubadora con agitación durante 24 h a 30 ° C. Las células se recolectaron a 10 000 g durante 10 min y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Para la expresión de OCP (OCP1 existente, gen SYNY3 slr1963 y OCP ancestrales), las construcciones pRSFDuetM-OCPxx correspondientes se transformaron en E. coli BL21 (DE3) productora de equinenona, que alberga un plásmido p25crtO. Las expresiones se realizaron en 1 l de LB, suplementado con cloranfenicol (34 µg ml−1) y Kan (50 µg ml−1), al cual se le inoculó 10 ml de cultivo nocturno, y se hizo crecer en incubadora con agitación a 37° C hasta OD600nm = 0,6–0,8. Después de la inducción con IPTG 0,5 mM, las células se incubaron a 25 °C durante 72 h y finalmente se recogieron a 10 000 g durante 10 min y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Para la purificación, los sedimentos de células congeladas se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, fosfato 12 mM, pH 7,4), complementado con 100 mg de lisozima (Ovobest) e inhibidor de la proteasa (benzamidina 1 mM, ácido ε-amino-caproico 1 mM). La lisis celular se realizó utilizando una FrenchPress (G. Heinemann) en tres ciclos a 18.000 psi. Posteriormente, los restos celulares se sedimentaron a 18 000 g durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante se cargó en una columna de crudo de 5 ml Co2+-HiTrap Talon (Cytiva) usando una bomba peristáltica. La elución se llevó a cabo con tampón que contenía imidazol (1x PBS + imidazol 350 mM, pH 7,4), complementado con proteasa HRV 3C en una proporción de masa total de 500:1 (proteína a proteasa) y se dializó a 4 °C en proteasa 3C. tampón (Tris 20 mM, NaCl 100 mM, ditiotreitol 2 mM, pH 8,5) durante 18 h. La solución de proteína se recargó en una columna de crudo Co2+-HiTrap Talon mientras que esta vez se recolectó el flujo. En el caso de FRP, la purificación se realizó mediante SEC para el pulido, mientras que la purificación con OCP continuó con cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) para eliminar la apoproteína. Los flujos directos de OCP recogidos se dializaron durante la noche en tampón HIC ((NH4)2SO4 500 mM, urea 100 mM, fosfato 5 mM, pH 7,5) a 4 °C. La HIC se realizó en una columna HiPrepTM 16/10 Phenyl HP (Cytiva) en un sistema automatizado Azura FPLC (Knauer). Las proteínas se eluyeron con un tampón hidrofílico (urea 100 mM, fosfato 5 mM, pH 7,5). Las fracciones de proteínas ricas en carotenoides se concentraron usando unidades de filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 10 kDa (Pall Corporation) para SEC. El FRP se concentró con unidades de filtro centrífugo MWCO de 3 kDa. Luego, se cargaron 500 µl de cada solución de proteína concentrada en una columna SuperdexTM 200 Increment 10/300 (Cytiva) y se eluyeron con 1x PBS. Las proteínas se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Las secuencias con codones optimizados que codifican las proteínas FRPL, FRP ancestral y FRPL ancestral existentes se obtuvieron de Integrated DNA Technologies (IDT) o Twist Biosciences. Se clonaron en vectores pET-LIC que contenían una etiqueta 6xHis N- o C-terminal utilizando Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs). Los oligonucleótidos utilizados se muestran en la Tabla complementaria 1. Sanger Sequencing (Microsynth) verificó el ensamblaje correcto. Los plásmidos se transformaron en E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen). Para la sobreproducción de proteínas, se inocularon 50 ml de LB, suplementados con carbenicilina (Carb) (100 μg ml−1), con una sola colonia de una placa fresca de LB + Carb, y se cultivaron durante la noche a 37 °C en una incubadora con agitación. Seis lotes de 500 ml de LB + Carb se inocularon con cultivos durante la noche a OD600nm = 0,01 y se cultivaron hasta OD600nm = 0,6–0,8 durante aproximadamente 2,5 h. La sobreproducción de proteínas se indujo con IPTG 1 mM. Después de 4 h, las células se recolectaron a 4392 g durante 20 min a 4 °C y los sedimentos celulares se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Para la purificación, las células se resuspendieron en 35 ml de tampón A (NaCl 300 mM, Tris 20 mM, imidazol 20 mM, β-mercaptoetanol 5 mM, pH 8,0) y se añadió una tableta de cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (Roche). Las células se rompieron dos veces en un microfluidificador LM10 (Microfluidics) a 13.000 psi. El lisado se aclaró mediante centrifugación a 29.930 g durante 30 min, y se pasó a través de un filtro de jeringa de 0,45 µm, luego se cargó en un cartucho IMAC de 5 ml Bio-Scale Mini Nuvia con carga de Ni (BioRad). Después de lavar con 25 ml de tampón A, la proteína se eluyó con un gradiente lineal sobre 20 ml de 0 a 100 % de tampón B (NaCl 300 mM, Tris 20 mM, imidazol 500 mM, β-mercaptoetanol 5 mM, pH 8,0) en un sistema NGC (BioRad). Las fracciones que contenían la proteína se verificaron en geles SDS al 15 % moldeados internamente y se agruparon para SEC con una columna HiLoad 26/600 Superdex (Cytiva) en tampón SEC (NaCl 200 mM, KCl 20 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5). ) en un sistema NGC. La pureza de las fracciones que contenían la proteína se verificó en geles de SDS al 15 % moldeados internamente y se agruparon para la concentración a 2000 g con unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra (Millipore) con un MWCO de 3 kDa. Las proteínas se almacenaron a -20 °C hasta su uso.

Para analizar el contenido de carotenoides de las holoproteínas OCP, se mezclaron 50 µl de solución de proteína concentrada con 1 ml de acetona y se centrifugaron a máxima velocidad a 4 °C para reducir la proteína precipitada. El sobrenadante amarillento se evaporó en un concentrador de vacío centrífugo (Eppendorf) a 30 °C hasta que la acetona se evaporó completamente y los carotenoides precipitaron como cristales rojos. Se eliminó la solución de agua restante y se volvieron a disolver los cristales de carotenoides rojos en 50 µl de acetona. La solución rica en carotenoides se transfirió a un vial de muestra que se colocó en un sistema UFLC NexeraX2 (Shimadzu), equipado con una columna Accucore C30 (Thermo Fisher Scientific, 250 × 2,1 mm, tamaño de partícula de 2,6 µm, tamaño de poro de 150 Å). Como eluyentes de la fase móvil, se utilizaron tampón A (metanol a agua, 95:5) y tampón B (metanol a THF, 7:3) con el siguiente protocolo: 0–4,3 min 0 % de tampón B, 4,3–8,6 min lineal gradiente de 0 a 100 % de tampón B, 8,6–15,6 min 100 % de tampón B, 15,6–20,1 min 0 % de tampón B con un caudal constante de 0,4 ml min−1. Los carotenoides eluidos se verificaron mediante espectrometría de masas para correlacionar los tiempos de elución con especies de carotenoides específicas, así como mediante cromatografía de capa fina y comparación con muestras de referencia.

Los espectros de absorción se registraron con un espectrómetro Maya2000Pro (Ocean Optics), acoplado a través de una fibra a una fuente de luz de deuterio tungsteno (Sarspec) y un portacubetas (CVH100, Thorlabs). Para los análisis cinéticos de OCP/FRP, se acopló por fibra un soporte de cubetas de temperatura controlada con un dispositivo de agitación constante qpod2e (Quantum Northwest) a un espectrómetro CCS100/M (Thorlabs) y una fuente de luz de tungsteno SLS201L/M (Thorlabs). Para la iluminación con luz actínica se utilizó un diodo emisor de luz (Avonec) de 3 W con una emisión máxima a 455 nm. Diferentes OCPO (mezclados con diferentes FRP existentes o ancestrales o FRPL existentes o ancestrales en varias proporciones molares, o solos) se cambiaron por foto al estado rojo (OCPR) aplicando luz azul durante al menos 3 min y 30 s o hasta una meseta se alcanzó, y la foto-recuperación se siguió constantemente a 550 nm después de apagar la fuente de luz azul. Las constantes de tiempo de recuperación (τ) se determinaron ajustando las curvas de relajación de las conversiones inversas de OCPR a OCPO con una función de decaimiento monoexponencial y se calcularon las desviaciones estándar (sd) de tres réplicas independientes.

Se utilizó espectroscopia de dicroísmo circular ultravioleta lejano para evaluar la estructura secundaria de P. borbori FRPL (PbFRPL) producido heterólogamente en solución. La proteína se diluyó a una concentración de aproximadamente 50 µg ml-1 en tampón de dicroísmo circular (NaF 100 mM, Na2HPO4/NaH2PO4 10 mM, pH 7,5), y se midió en una cubeta de 0,1 cm a temperatura ambiente usando un JASCO J-810 espectropolarímetro (Jacso) en el rango de 190 a 240 nm en pasos de exploración de 0,2 nm. Se registraron tres espectros sucesivos, se corrigió la línea base y se promedió.

La muestra de proteína FRPL de P. borbori (PbFRPL) se almacenó a -20 °C antes de cambiar el tampón por acetato de amonio 200 mM (pH 6,8) mediante varias rondas de concentración y dilución utilizando concentradores de proteína Pierce (Thermo Fisher). Luego, la muestra se diluyó a 4 µM (monómero) inmediatamente antes de las mediciones. Los datos se recopilaron utilizando capilares chapados en oro internos en un espectrómetro de masas Q Exactive (ThermoFisher Scientific), operado en modo de iones positivos con una temperatura de fuente de 100 °C y un voltaje capilar de 1,2 kV. La captura en la fuente se configuró en −100 V para ayudar con la disociación de pequeños aductos de iones. La óptica de transferencia de iones y los gradientes de voltaje en todos los instrumentos se optimizaron para una transmisión ideal. Los espectros se adquirieron con diez microescaneos para aumentar la relación señal-ruido con tiempos transitorios de 64 ms, correspondientes a la resolución de 17 500 en m/z = 200, y un objetivo de AGC de 1,0 × 106. El parámetro de umbral de ruido fue establecido en tres y el rango de escaneo utilizado fue de 350 a 8,000 m/z.

La cristalización de P. borbori FRPL (PbFRPL) se realizó mediante el método de gota colgante a 20 °C en gotas de 2 µl, que constaban de cantidades iguales de proteínas y soluciones de precipitación. PbFRPL cristalizó a 119 µM en 20 días en Li2SO4 0,2 M, CHES 0,1 M, pH 9,5 y tartrato de sodio:potasio 1,4 M. Antes de la recopilación de datos, los cristales se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido sin el uso de crioprotectores. Los datos de sincrotrón se recopilaron en condiciones criogénicas en la línea de luz P13, operada por el Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) de Hamburgo en el anillo de almacenamiento PETRA III (Deutsches Elektronen Synchrotron)46. Los datos se integraron y escalaron con XDS y se fusionaron con XSCALE47. Las estructuras se determinaron por reemplazo molecular con PHASER48, se construyeron manualmente en COOT49 y se refinaron con PHENIX50. Para la determinación de la estructura por reemplazo molecular, la estructura cristalina de FRP de Synechocystis sp. Se utilizó PCC 6803 (PDB ID 4JDX, ref. 25) como modelo de búsqueda. La estructura final de PbFRPL se cargó en RCSB PDB con el número de acceso 8AG8. Los datos se renderizaron y visualizaron con PyMol (v.2.4.0)51.

Después de varias rondas de cultivo, volvimos a secuenciar todo el genoma de P. borbori para descartar la pérdida del gen frpl en el cultivo (una posible explicación de la ausencia de FRPL en todos los organismos modelo), la localización del plásmido (que podría facilitar la HGT) o la contaminación de la muestra. , pero descubrió que el genoma era un único cromosoma circular de 5,34 MB de tamaño, lo que implicaba una copia del gen frpl, pero ningún homólogo de OCP, HCP o CTDH (Datos ampliados Fig. 7d). El ADN genómico de P. borbori en fase estacionaria se obtuvo usando el kit de ADN NucleoBond HMW (Macherey-Nagel) de acuerdo con las pautas del fabricante, y usando lisozima para la lisis celular (concentración final 1 mg ml−1) durante 1 h a 37 °C en 2 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. La calidad y la concentración del ADN se evaluaron mediante el espectrofotómetro NanoDrop 8000 y el fluorómetro Qubit 3 utilizando reactivos BR de ADN de doble cadena. La preparación de la biblioteca se realizó con el kit de secuenciación de ligadura SQK-LSK109 (Oxford Nanopore Technologies), de acuerdo con las pautas del fabricante, excepto que el ADN de entrada se quintuplicó para que coincidiera con la molaridad esperada en el protocolo, ya que no se aplicó corte de ADN. La secuenciación se realizó en un dispositivo MinION Mk1B durante 24 h utilizando una 'célula de flujo Flongle' (FLO-FLG001, química celular R9.4.1). Los datos de Nanopore se llamaron base con el software de llamada base ONT Guppy. Las lecturas largas se ensamblaron usando canu52, lo que resultó en un solo cromosoma circular. Las lecturas sin procesar se depositan en el Archivo de lectura de secuencias del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y se puede acceder a ellas bajo BioProject no. PRJNA865569 y número de acceso de BioSample. SAMN30120905.

La tinción tipo DSM17834 de la delta-proteobacterium P. borbori se adquirió de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania). Se cultivó aeróbicamente en medio PME (0,5% peptona, 0,3% extracto de carne, pH 7,0) a 28 °C y se registró una curva de crecimiento por triplicado biológico. El tiempo de generación (G) durante el crecimiento exponencial se estimó usando la fórmula \(G = \frac{{{{\Delta }}t}}{{3.3\log \left( {\frac{{{\mathrm{OD} }_2}}{{{\mathrm{OD}}_1}}} \right)}}\).

Las fusiones de proteínas para la localización in vivo con microscopía de epifluorescencia se generaron mediante la amplificación por PCR del gen frpl de P. borbori, incluidos 200 pb de la región 5 'no traducida y la inserción en vectores pSG1164 con una secuencia codificante de mVenus N- o C-terminal y una secuencia enlazadora 'GGGGGSL' en marco utilizando Gibson Assembly Master Mix (NEB). El ensamblaje correcto fue verificado por Sanger Sequencing (Microsynth). Se prepararon P. borbori químicamente competentes mediante la modificación de un protocolo de Irani y John53, desarrollado inicialmente para P. aeruginosa, de la siguiente manera: el medio se cambió a PME y las temperaturas se redujeron a 28 °C. Los plásmidos se transformaron en P. borbori siguiendo el protocolo de transformación de Irani y John53, pero cambiando la temperatura de choque térmico a 30 °C, el medio a PME, la temperatura de crecimiento a 28 °C y la concentración de carbenicilina a 100 µg ml−1. Las placas se incubaron a 28 °C durante 48 h hasta que se observaron las colonias.

Para la microscopía de epifluorescencia, las células de P. borbori se cultivaron a 28 °C y 200 rpm a OD600 = 0,6 para "crecimiento exponencial" y durante 2 días a OD600 de alrededor de 1,0 para condiciones de "inanición" en medios PME. Las células se fijaron en almohadillas de agarosa al 1% intercalando 100 µl de agarosa fundida entre dos cubreobjetos (12 mm, Menzel). Luego se añadieron 3 µl del cultivo a un cubreobjetos redondo (25 mm; Marienfeld) y se fijó con una almohadilla de agarosa. Para la adquisición de imágenes de campo amplio, se utilizó un microscopio Zeiss Observer A1 (Carl Zeiss) con un objetivo de inmersión en aceite (aumento de ×100, apertura numérica de 1,45, alfa Plan-FLUAR; Carl Zeiss) con una cámara con dispositivo de carga acoplada (CoolSNAP EZ; Photometrics) y una iluminación de fluorescencia de halogenuros metálicos HXP 120 con control de intensidad. Para la microscopía de epifluorescencia, se utilizó un conjunto de filtros de proteínas fluorescentes verdes (BrightLine 470/40, Beamsplitter 495 y Brightline 525/50). Las muestras se iluminaron durante 0,5 a 2 s en el plano medio de la celda. La fluorescencia integrada de células enteras se determinó por célula y se corrigió para la fluorescencia de fondo. La edición final de las imágenes se realizó en ImageJ2/ FIJI (v.1.52)54,55.

La SEC analítica se realizó con una columna Superdex 75 Increment 3,2/300 (Cytiva), equilibrada con PBS 1x a un caudal de 0,1 ml min−1 y un volumen total de inyección de muestra de 20 µl. Para medir con iluminación de luz azul, se montaron cuatro LED de 3 W (Avonec) con un máximo de emisión a 455 nm en un disipador de calor de 20 cm a distancias constantes frente a la columna SEC para iluminar continuamente la muestra en la columna. La absorción se registró a 280, 496 y 550 nm para seguir los perfiles de elución.

Los modelos del complejo de proteínas AlphaFold2 se generaron utilizando el servidor ColabFold56 el 20 de mayo de 2022, utilizando como secuencias de entrada el CTD de OCP1 de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) o AncOCPall y FRP (SYNY3) con configuración predeterminada. Además, la estructura de AncOCPall de longitud completa se predijo por separado. El 3 de noviembre de 2022, repetimos el análisis con el CTD de OCPx de G. kilaueensis JS1 o un mutante S264Y (la serina en la posición 264 (numeración SYNY3) se cambió a tirosina) de ese OCPx con FRP (SYNY3). Las estructuras modeladas se depositan en los datos de origen. Los datos se renderizaron y visualizaron con PyMol (v.2.4.0)51.

La PAGE nativa se realizó en una Mini-Protean Tetra Cell (Biorad) mediante el uso de geles de gradiente moldeados internos con una concentración de acrilamida del 3 al 14 % en un sistema de tampón Tris-glicina sin SDS para obtener condiciones de proteína nativa. No se utilizó gel de apilamiento. La cámara de electroforesis se enfrió constantemente en un refrigerador y se iluminó con cuatro LED de 3 W (Avonec) con un máximo de emisión a 455 nm para foto-cambiar las proteínas OCP en el gel. El voltaje se fijó a 80 V de forma constante durante 240 min y, posteriormente, a 120 V durante otros 100 min.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen están disponibles en el Repositorio de datos de investigación abierta de la Sociedad Max Planck (Edmond) en https://doi.org/10.17617/3.44RHFZ. Los datos de cristalografía están disponibles en RCSB PDB con el número de acceso 8AG8. Los datos de secuenciación están disponibles en NCBI Sequence Read Archive bajo BioProject PRJNA865569.

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NS, SGG y GKAH cuentan con el apoyo de la Sociedad Max Planck. AARR y D.Schindler están financiados por la Sociedad Max Planck en el marco del proyecto MaxGENESYS. TF agradece la financiación de Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvención n.º FR 1276/5-1 y FR 1276/6-1) y la concesión de la Fundación Einstein para la máquina Azura FPLC. Cofinanciado por la Unión Europea (ERC, EVOCATION, 101040472). Sin embargo, los puntos de vista y las opiniones expresadas pertenecen únicamente al autor o autores y no reflejan necesariamente las de la Unión Europea o el Consejo Europeo de Investigación. Ni la Unión Europea ni la autoridad otorgante pueden ser considerados responsables de ellos. PLG agradece el apoyo de Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvención n.º GR1670/27-1). JLPB y D.Saman. Agradecemos el apoyo del fideicomiso Leverhulme (subvención n.º RPG-2021-246). A los efectos del acceso abierto, JLPB ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a la versión del manuscrito aceptado por el autor que surge de este envío. Agradecemos a NN Tavraz (TU Berlín) y C.-N. Mais (Universidad de Marburg) por el apoyo de laboratorio.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Sociedad Max Planck.

Estos autores contribuyeron igualmente: Niklas Steube, Marcus Moldenhauer.

Instituto Max Planck de Microbiología Terrestre, Marburg, Alemania

Niklas Steube, Adán A. Ramírez Rojas, Sriram G. Garg, Daniel Schindler & Georg KA Hochberg

Instituto de Química PC14, Universidad Técnica de Berlín, Berlín, Alemania

Marcus Moldenhauer y Thomas Friedrich

Departamento de Química, Universidad de Marburg, Marburg, Alemania

Paul Weiland, Alexandra Kilb, Peter L. Graumann, Gert Bange y Georg KA Hochberg

Centro de Microbiología Sintética (SYNMIKRO), Marburg, Alemania

Paul Weiland, Alexandra Kilb, Daniel Schindler, Peter L. Graumann, Gert Bange y Georg KA Hochberg

Departamento de Química, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Dominic Saman y Justin LP Benesch

Instituto Kavli para el Descubrimiento de la Nanociencia, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Dominic Saman y Justin LP Benesch

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NS, MM, TF y GKAH concibieron el proyecto y supervisaron la redacción del manuscrito. NS realizó filogenética, reconstrucción de secuencias ancestrales, purificación de proteínas, espectroscopia de dicroísmo circular y manipulación genética de P. borbori. MM realizó experimentos de purificación de proteínas, biofísicos y bioquímicos. PW y GB realizaron cristalografía de proteínas e interpretaron los datos. AK y PLG realizaron microscopía de epifluorescencia e interpretaron los datos. D.Saman y JLPB realizaron espectrometría de masas nativa e interpretaron los datos. AARR y D.Schindler secuenciaron P. borbori y analizaron los datos. SGG infirió los árboles de especies filogenéticos y realizó la reconciliación del árbol de genes y el árbol de especies. NS, MM, TF y GKAH interpretaron todos los datos. Todos los autores contribuyeron a la redacción y discusión del manuscrito.

Correspondencia a Thomas Friedrich o Georg KA Hochberg.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Ecology & Evolution agradece a Per Jemth y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Filogenia ML de proteínas OCP con proteínas ancestrales reconstruidas (Anc) en nodos etiquetados y proteínas similares al dominio C-terminal (CTDH) de cianobacterias como el grupo externo (insertar con contornos negros). Los parálogos y ancestros de OCP están codificados por colores como en la Fig. 1b. Además, probamos una secuencia más conservadora para el último ancestro común de OCP1 (conAncOCP1, en gris) (Datos extendidos Fig. 3a+e, 4d,h,l,p,t) así como ancestros alternativos 'altAll' para cada nodo en este árbol (Datos extendidos Figs. 3a, 5a-l). Los números en cursiva son las probabilidades de Bootstrap de Felsenstein (FBP) de 100 repeticiones. Los números grises son valores aproximados de prueba de razón de verosimilitud (aLRT). Las longitudes de las ramas representan las sustituciones promedio por sitio. Insertar con contornos grises es un acercamiento triple para mostrar correctamente la topología de la rama en esa área. Alineación de secuencias múltiples subyacente en Datos complementarios 1.

Filogenia ML de proteínas OCP como en Extended Data Fig. 1, pero con proteínas carotenoides helicoidales de cianobacterias (HCP, inserto) como grupo externo. Alineación de secuencias múltiples subyacente en Datos complementarios 1. Aquí no se reconstruyeron antepasados.

a, Alineación de secuencias múltiples de OCP1 de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) con secuencias OCP ancestrales reconstruidas y respectivas secuencias alternativas (alt). Se indican los estados importantes para la dimerización de OCP1O16, OCP1R29, la desaceleración de OCP1 y la interacción con FRP7, y se muestran en rojo si se conservan o en azul si no. La numeración de los residuos sigue a SYNY3 OCP1. Las regiones de dominio C-terminal (CTD), enlazador y dominio N-terminal (NTD) se etiquetan en consecuencia. El OCP1 ancestral más conservador (conAncOCP1) y su secuencia alternativa que no aparecen en el texto principal están en gris. be, Distribución de probabilidades posteriores (pp) por sitio con 20 categorías de contenedores por secuencia reconstruida con la media y el número de sitios ambiguos mostrados. Los sitios se consideraron ambiguos si pp > 0,2 para el estado con el segundo pp más alto y se reemplazaron con esos estados en los alt antepasados.

ad, geles de poliacrilamida 12 % SDS de purificaciones de proteínas ancestrales. l, lisado. pies, flujo a través. w, lavado. e, elución. -su, después de su-etiqueta de escote. sí, después de la cromatografía de exclusión por tamaño. Las purificaciones se repitieron tres veces con resultados similares. eh, espectros de absorción UV-Vis del estado naranja inactivo y rojo activo de los OCP ancestrales. ip, Recuperación de la fotoconversión de OCP ancestrales con (en proporciones molares de 5 OCP a 1 FRP) o sin FRP existente de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) como se indica a diferentes temperaturas. qt, gráficos de Arrhenius de recuperación de la fotoconversión con (rojo) o sin SYNY3 FRP (negro). uy, recuperación de la fotoconversión de OCP ancestrales solos o con diferentes FRP ancestrales o FRPL ancestrales o FRPL existente de Pseudomonas borbori en diferentes proporciones molares como se indica a 20 °C con constantes de tiempo de recuperación media respectivas (τ) y sd de tres réplicas independientes. Los conjuntos de datos representativos se muestran para mayor claridad.

ad, geles de poliacrilamida 12 % SDS de purificaciones alternativas de proteínas ancestrales. l, lisado. pies, flujo a través. w, lavado. e, elución. -su, después de su-etiqueta de escote. sí, después de la cromatografía de exclusión por tamaño. Las purificaciones se repitieron tres veces con resultados similares. eh, espectros de absorción UV-Vis del estado naranja inactivo y rojo activo de OCP ancestrales alternativos. il, Recuperación de la fotoconversión de OCP ancestrales alternativos con (cian) o sin (negro) FRP existente de Synechocystis sp. PCC 6803 a 20 °C con las respectivas constantes de tiempo de recuperación promedio (τ) y sd de tres réplicas independientes. Se muestran conjuntos de datos representativos para mayor claridad; altAncOCPall es apenas foto-conmutable.

Filogenia de la especie ML con Felsenstein Bootstrap Probabilidades (FBP) de 100 repeticiones en cursiva. La apariencia de los parálogos de FRP y OCP se mapean junto a la filogenia. Los asteriscos indican entradas multiespecies en la base de datos BLAST39. El signo de exclamación marca la única cepa que carece de FRP mientras tiene OCP1. Alineación de la secuencia de aminoácidos subyacente en los datos complementarios 1.

a, h+i, geles de poliacrilamida SDS al 15 % de P. borbori, Mthylocaldum sp., Desulfobacteriaceae (D) y Chlorobi sp. (C) FRPL después de la cromatografía de exclusión por tamaño. Las purificaciones se repitieron tres veces con resultados similares. b, Espectros de dicroísmo circular (CD) de P. borbori FRPL (negro) en tampón de CD (gris). c, datos de espectrometría de masas nativos de P. borbori FRPL. d, Estadísticas de secuenciación de nanoporos. e, Curva de crecimiento de P. borbori en triplicados biológicos con media y desviación estándar (SD) mostrada, y determinación del tiempo de generación (G) durante el crecimiento exponencial. f, microscopía de epifluorescencia de cepas de P. borbori que no expresan ninguna (WT), solo mVenus (mVenus) o proteínas de fusión FRPL con fusión mVenus N- o C-terminal. Se muestra la fluorescencia integrada de células completas con la media y la desviación estándar, la imagen de campo claro (BF), la señal del canal GFP (mVenus) y una superposición de ambas (fusión). Las flechas rojas apuntan a focos de señal en los polos de las células. La barra de escala representa 2 μm y se aplica a todas las imágenes. g, se realizaron pruebas t de Welch de dos colas para comparar la fluorescencia integrada media de células completas con *** p < 0,001, ** p = 0,013, ns, no significativo (p = 0,580); n = 28 celdas por condición. Los cuadros se extienden desde los valores intercuartílicos inferiores a los superiores de los datos, con una línea en la mediana. Los bigotes muestran datos dentro de rangos intercuartílicos de ± 1,5. Los círculos son valores atípicos. j + k, Recuperación de la fotoconversión de OCP1 de Synechocystis sp. PCC 6803 con FRPL existente como se indica a 20 °C con constantes de tiempo de recuperación media respectivas (τ) y SD de tres réplicas independientes. Los conjuntos de datos representativos se muestran para mayor claridad.

a, alineación de la secuencia de aminoácidos de FRP de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) con FRPL ancestrales existentes y reconstruidos y FRP ancestrales. Se señalan los sitios importantes para la homodimerización y la interacción con OCP1 en FRP7,8, y en rojo si se conservan o en azul si no. La numeración sigue SYNY3 FRP. Árboles ML para las reconstrucciones en la Fig. 1 + 2 complementaria. b + c, f + g, Distribución de probabilidades posteriores (pp) por sitio con 20 categorías bin por secuencia reconstruida con la media y el número de sitios ambiguos con pp > 0.2 para el estado con el segundo pp más alto mostrado. d+h, geles de poliacrilamida SDS al 15 % de proteínas ancestrales tras cromatografía de exclusión por tamaño. Las purificaciones se repitieron tres veces con resultados similares. conc., concentrado. e, árbol filogenético FRP(L) inicial sin raíz utilizado para la reconstrucción de ancestros alternativos (alt) en los nodos indicados. Las longitudes de las ramas representan las sustituciones promedio por sitio. Árbol completo en la Fig. 2 complementaria. HGT, transferencia horizontal de genes. TBE, Expectativa Bootstrap de transferencia. i + j, recuperación de la fotoconversión de SYNY3 OCP1 con FRP ancestral alternativo (altFRPpostHGT) o FRPL ancestral alternativo (altFRPLpreHGT) como se indica en diferentes proporciones molares a 20 °C con constantes de tiempo de recuperación media respectivas (τ) y sd de tres réplicas independientes. Los conjuntos de datos representativos se muestran para mayor claridad. nd, no determinable.

a + b, Estimación de confianza por residuo (pLDDT) de los modelos AlphaFold2 que se muestran en la Fig. 4d + e. c, Confianza del AncOCPall de longitud completa pronosticado con residuos indicados en el dominio C-terminal (CTD) involucrado en la interacción pronosticada con FRP de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) que están bloqueados por la extensión N-terminal (NTE, en magenta) en el estado naranja compacto de AncOCPall predicho aquí. NTD, dominio N-terminal. d, Confianza de la interacción modelada entre AncOCPall y SYNY3 FRP. por ejemplo, errores alineados previstos (PAE). h + i, los modelos AlphaFold2 de CTD de OCPx de Gloeobacter kilaueensis JS1 no predicen una interacción con SYNY3 FRP en la interfaz esperada (de acuerdo con los datos experimentales30), a menos que la serina (S) en la posición 264 (numeración SYNY3) se cambie por tirosina (Y ), el estado ancestral en AncOCPall que se muestra más adelante en superposición aquí. Los insertos muestran PAE.

Figs suplementarias. 1–3, Tabla 1 y Discusión.

Múltiples alineaciones de secuencias subyacentes de datos extendidos Figs. 1, 2 y 6 y las Figs. complementarias. 1 y 2

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Reimpresiones y permisos

Steube, N., Moldenhauer, M., Weiland, P. et al. Las superficies de proteínas compatibles fortuitamente prepararon el control alostérico en la fotoprotección de cianobacterias. Nat Ecol Evol 7, 756–767 (2023). https://doi.org/10.1038/s41559-023-02018-8

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Recibido: 05 Septiembre 2022

Aceptado: 21 de febrero de 2023

Publicado: 03 abril 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41559-023-02018-8

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