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Dec 19, 2023

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 885 (2023) Citar este artículo

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Los cnidocitos son las células urticantes explosivas exclusivas de los cnidarios (corales, medusas, etc.). Especializados en la captura y defensa de presas, los cnidocitos comprenden un grupo de más de 30 tipos de células morfológica y funcionalmente distintas. Estas células inusuales son ejemplos icónicos de la novedad biológica, pero los mecanismos de desarrollo que impulsan la diversidad del aparato urticante están mal caracterizados, lo que dificulta la comprensión de la historia evolutiva de las células urticantes. Usando la edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 en la anémona de mar Nematostella vectensis, mostramos que un solo factor de transcripción (NvSox2) actúa como un interruptor binario entre dos destinos alternativos de células urticantes. La eliminación de NvSox2 provoca una transformación de las células penetrantes en células atrapantes, que son comunes en otras especies de anémonas de mar pero parecen haber sido silenciadas en N. vectensis. Estos resultados revelan un caso inusual de atavismo unicelular y amplían nuestra comprensión de la diversificación de la identidad del tipo celular.

Nuevos tipos de células promueven el origen de nuevas funciones fisiológicas y son esenciales para la expansión de la diversidad de organismos; sin embargo, comprender los mecanismos que impulsan el origen de nuevos tipos de células es un desafío persistente en biología1,2. Los estudios de evolución de rasgos en organismos multicelulares han identificado la "homeosis" (la transformación de una parte de un organismo en otra parte3) como una fuente importante de innovación morfológica. Ejemplos comunes de tales novedades homeóticas incluyen la conversión de pétalos en sépalos en plantas con flores y la transformación de segmentos abdominales en torácicos en insectos4. Desde entonces, se ha demostrado que estas transformaciones están controladas por genes reguladores expresados ​​regionalmente5,6, lo que demuestra cómo el desarrollo de fenotipos complejos puede coordinarse mediante un solo interruptor genético. Más recientemente, se ha invocado la homeosis para explicar cómo pueden ocurrir transformaciones a nivel de una sola célula. Los estudios de diferenciación neuronal en nematodos, moscas y vertebrados han identificado genes reguladores individuales suficientes para convertir un subtipo neuronal en otro, lo que respalda la idea de que la homeosis puede controlar la individuación del destino celular7. Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha demostrado la inducción homeótica del atavismo (el resurgimiento de un carácter ancestral) a nivel de un tipo de célula individual. Tal demostración proporcionaría una comprensión mecánica de cómo la homeosis podría impulsar la diversificación de tipos de células y promover la expansión de la complejidad animal.

Las células urticantes (cnidocitos) se encuentran entre los tipos de células más complejos desde el punto de vista morfológico y son un ejemplo icónico de una novedad celular (Fig. 1). Las células urticantes, que se encuentran exclusivamente en los cnidarios (un clado que incluye corales, medusas y sus parientes), comprenden una diversa gama de células especializadas en la captura de presas, la defensa y el uso del hábitat que varían ampliamente tanto en forma como en función entre los taxones8. De hecho, el conjunto de tipos de células urticantes que se encuentran en cada especie de cnidario es posiblemente el carácter de diagnóstico más informativo para los taxones de cuerpo blando, que comprenden más de 2/3 de las 13 000 especies de cnidarios existentes9,10. Actualmente se reconocen tres subtipos principales de células urticantes y se pueden discriminar por la morfología de su orgánulo urticante11. Los primeros, los nematocitos ("células perforantes") (Fig. 1a–c, g, h), tienen un orgánulo explosivo con una pared de cápsula gruesa que contiene un túbulo eversible cargado de veneno12,13,14,15. Entre los cnidarios, se han descrito más de 30 tipos diferentes de nematocitos, que difieren en gran medida en la morfología de la porción espinosa basal del túbulo (en lo sucesivo, el "arpón")8. El segundo tipo de células urticantes, los espirocitos ("células atrapantes"), exhiben una variación morfológica mucho menor y se describen como gráciles (delgadas) o robustas (gruesas) en apariencia general16. Aunque todavía son extrusivas, estas células se caracterizan por dos características que no se encuentran en las células perforantes: una pared de la cápsula delgada con una apariencia dentada, derivada de una red de fibras regularmente espaciadas que recubren la pared interna de la cápsula, y un túbulo eversible adornado con finas varillas laterales que crear una red atrapante al descargar17 (Fig. 1d–f, i). No se sabe que el tercer grupo de células urticantes, los pticocitos ("células adherentes"), contengan toxinas y su carga útil consiste solo en un túbulo plisado y pegajoso doblado dentro de una cápsula de paredes delgadas18 (Fig. 1j-l). La amplia distribución de células perforantes (nematocitos) en todo el filo sugiere que este tipo de células estuvo presente en el último ancestro común de los cnidarios (Fig. 1m). La distribución más restringida de tipos de células atrapantes y adherentes (espirocitos y ptocitos, respectivamente) implica que estos tipos de células evolucionaron a partir de un ancestro perforador. Sin embargo, no se han caracterizado los mecanismos de desarrollo que controlan la variabilidad en la morfología del aparato punzante. Los factores evolutivos que impulsan la diversificación de estos tipos de células inusuales, por lo tanto, siguen sin resolverse.

a, b Nematocito descargado (SEM) del mesenterio de la anémona de mar Nematostella vectensis que muestra colgajos apicales (b: verde, color falso) y espinas a lo largo del arpón evertido (flecha blanca). c Ápice de nematocito no descargado (TEM) del mesenterio de N. vectensis que muestra los colgajos apicales (verde) y la pared de la cápsula gruesa (puntas de flecha). d Descarga de espirocitos (SEM) de los tentáculos de la anémona de mar Calliactis tricolor que muestra la falta de aletas apicales y sin espinas en el túbulo evertido (flecha blanca). e, f Espirocitos no descargados (TEM) de los tentáculos de N. vectensis que muestran una tapa apical (naranja, color falso) y una pared de cápsula delgada y dentada (puntas de flecha blancas). La apariencia aserrada de la pared de la cápsula del espirocito surge de una red interna de fibras regularmente espaciadas (puntas de flecha blancas en f). Finos bastones laterales adornan el túbulo y aparecen como pequeños puntos oscuros en la sección transversal (punta de flecha negra en e). g, h SEM de una cápsula de nematocisto rota de N. vectensis que muestra la pared gruesa de la cápsula (puntas de flecha negras). i Cápsula de espirocito intacta de N. vectensis; las espirales del túbulo son visibles a través de la delgada pared de la cápsula (dos espirales están delineadas con líneas discontinuas). j Pticocito descargado (SEM) de la pared del cuerpo de la anémona tubular Ceriantheopsis americana; el túbulo evertido carece de espinas pero tiene pliegues longitudinales (flecha blanca). k Ápice de ptocito no descargado de la pared del cuerpo de C. americana que no muestra especialización (púrpura, color falso). l Sección transversal del túbulo plisado dentro de la cápsula de un ptocito no descargado de C. americana; la pared de la cápsula es delgada y no aserrada (puntas de flecha blancas). m Cladograma de cnidarios, según Kayal et al.10; los recuadros a la derecha indican la presencia (gris) o ausencia (blanco) de cada tipo de célula urticante. Los orígenes hipotéticos de los tres tipos de células urticantes se trazan en el árbol. El gris punteado refleja células urticantes altamente derivadas en mixozoos. Nematocito N, espirocito S, ptocito P. *Hexacorales no ceriantídeos; este clado actualmente no tiene un nombre aceptado. +Mixozoos y Polypodium.

Los genes Sox son una familia de factores de transcripción que desempeñan un papel instructivo en las decisiones sobre el destino de las células en los animales19. La expresión restringida a tejido de varios ortólogos de Sox se ha demostrado previamente en cnidarios y es consistente con el papel de estos factores de transcripción en el patrón de distintos tipos de células20,21,22,23,24. Aquí, mostramos que un solo gen Sox, NvSox2, regula un cambio homeótico entre dos destinos alternativos de células punzantes: perforar y atrapar. Interpretados en el contexto de la filogenia de las anémonas de mar, estos resultados proporcionan una explicación de la distribución discontinua de distintos tipos de células urticantes en los cnidarios y sugieren que el atavismo unicelular puede ser un mecanismo importante que impulsa la evolución de la novedad.

En N. vectensis, las células urticantes se encuentran en todo el epitelio ectodérmico, pero cada región del animal está poblada por una combinación distinta de tipos de células urticantes25. Las puntas de los tentáculos, por ejemplo, están pobladas por nematocitos isorhiza basítricos grandes y pequeños (células perforantes) y espirocitos gráciles (células atrapantes), mientras que la pared del cuerpo (epitelio externo) está poblada exclusivamente por células perforantes grandes y pequeñas (Fig. 2a, b ). Los epitelios ectodérmicos de los mesenterios (tejidos digestivos) están poblados en gran parte por mastigoforos microbásicos (otro tipo de célula perforante) y el pie está poblado casi exclusivamente por pequeñas isorizas basítricas (Fig. 2c, d). Las distribuciones y la abundancia relativa de los diferentes tipos de células urticantes se resumen en la Fig. 2b.

un pólipo primario marcado con DAPI 143 uM que muestra núcleos y cápsulas de nematocitos maduros (N = 10 pólipos); se indican basitrichs pequeños (azules) y grandes (amarillos). Recuadro: en los tentáculos abundan los espirocitos gráciles (magenta) y los basítricos grandes (amarillos). b Distribución de tipos de células urticantes en N. vectensis; ilustración modificada de: Babonis, LS, Ryan, JF, Enjolras, C. y Martindale, MQ El análisis genómico del triptoma revela los mecanismos moleculares de la evolución de las células glandulares. EvoDevo 10, 23 (2019)—CC BY 4.0. c Los mesenterios están poblados en gran parte por mastigophores (verde) (N = 12 pólipos). d Pequeños bastrichos dominan la pared del cuerpo y el pie (143uM DAPI) (N = 10 pólipos). e NvSox2 y PaxA se superponen en la expresión (N = 8 embriones); puntas de flecha blancas: celdas que expresan ambas, puntas de flecha negras: solo PaxA, círculos punteados: solo NvSox2. f NvSox2 está significativamente regulado a la baja en respuesta a la caída de SoxB2 (método ddCT, p = 1.12E-2) pero no se ve afectado significativamente por la caída de PaxA (ddCT, p = 0.345957) (qPCR). Las barras de error indican +/− desviación estándar. Se muestran tres experimentos repetidos para cada tratamiento (puntos negros); las barras grises indican los promedios de los tres experimentos. g Modelo de trabajo. h La expresión de NvSox2 está abolida en los mutantes de NvSox2. i Expresión de PaxA en los tentáculos (punta de flecha blanca y recuadro) y la pared del cuerpo (punta de flecha negra y recuadro) de tipos salvajes y mutantes (recuadro blanco y recuadro). j Análisis cuantitativo de células que expresan PaxA en la pared del cuerpo (Mann-Whitney U, p = 1.37E-11). Se examinaron N = 32 (tipo salvaje) y N = 30 (mutantes) animales por tratamiento (etapa de pólipo primario). k El ARNm de Mcol1 (magenta) se coexpresa con la proteína Mcol4 (α-Mcol4, cian) en los tentáculos (punta de flecha blanca) y la pared del cuerpo (recuadro blanco e inserción) de los tipos salvajes; La expresión de Mcol1 se reduce en la pared corporal de los mutantes NvSox2. Núcleos: blanco, DAPI. l Análisis cuantitativo de células en la pared corporal que expresan conjuntamente Mcol1 y Mcol4 (U de Mann-Whitney, p = 1,57E-4). N = 10 animales por tratamiento (etapa de yema de tentáculo). Polo oral a la izquierda en a, e, i, k. Para todos los diagramas de caja: mediana—línea media, percentiles 25 y 75—caja, percentiles 5 y 95—bigotes, valores atípicos—puntos individuales. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Las imágenes fluorescentes se ajustaron en contraste y brillo usando Fiji.

NvSox2 es uno de los 14 genes Sox en N. vectensis, solo dos de los cuales (SoxB2 y NvSox2) se expresan en células individuales en todo el ectodermo, un patrón consistente con la especificación de la identidad de la célula terminal durante la embriogénesis temprana20. Examinamos más a fondo la expresión de NvSox2 y descubrimos que se coexpresaba con el factor de transcripción PaxA en el desarrollo de células urticantes (Fig. 2e). Identificamos células que expresan solo NvSox2, células que expresan conjuntamente NvSox2 y PaxA, y células que expresan solo PaxA, lo que sugiere la activación secuencial de NvSox2 y luego de PaxA. Usando qPCR en combinación con la eliminación de genes mediada por morfolino, encontramos una supresión significativa de la expresión de NvSox2 después de la eliminación de SoxB2 (expresada en progenitores de neuronas y células urticantes)22 y ningún cambio significativo en la expresión de NvSox2 en respuesta a la eliminación de PaxA (Fig. 2f) ). Juntos, estos resultados sugieren que NvSox2 está aguas abajo de SoxB2 y aguas arriba de PaxA en las células urticantes de diferenciación temprana (Fig. 2g). Para comprender la función de NvSox2 en la especificación de células punzantes, utilizamos la edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 para generar knockouts homocigóticos F2 para el locus NvSox2 (Fig. 1 complementaria). NvSox2 se expresa por primera vez en la etapa de blástula y continúa expresándose durante el desarrollo temprano en células individuales dispersas por todo el ectodermo; esta expresión está completamente abolida en los mutantes NvSox2 (Fig. 2h, Fig. 2 complementaria). Permitimos que estos mutantes de NvSox2 crecieran hasta la etapa de pólipo para investigar los efectos moleculares y morfológicos resultantes de la pérdida de NvSox2.

Para comprender el papel molecular de NvSox2 en el destino de las células urticantes, examinamos la expresión de genes que se sabe que son específicos de las células urticantes en animales de tipo salvaje y animales knockout (mutantes) de NvSox225,26. La expresión del factor de transcripción PaxA (Fig. 2i, j; Fig. 3 complementaria) y la molécula estructural minicolágeno-1 (Mcol1; Fig. 2k, l) (ambos específicos de células perforantes) se redujeron significativamente en la pared corporal de NvSox2 mutantes Por el contrario, el minicolágeno-4 (Mcol4), que se encuentra en todos los tipos de células urticantes, no se vio afectado. El análisis cuantitativo del desarrollo de células urticantes reveló que el 80 % de las células marcadas con Mcol4 en la pared corporal de los pólipos de tipo salvaje también expresan Mcol1 y esta proporción se reduce significativamente a <10 % en los mutantes NvSox2 (Fig. 2l). Estos resultados confirman que la desactivación de NvSox2 no afectó el número total de células urticantes especificadas en la pared del cuerpo, pero transformó la identidad de las células urticantes en este tejido.

En N. vectensis, la pared del cuerpo de los pólipos de tipo salvaje está poblada casi exclusivamente por un solo tipo de célula perforante, la pequeña isorhiza basítrica (Fig. 3a)27,28. Para investigar más a fondo los efectos de la inactivación de NvSox2 en el desarrollo de las células urticantes de la pared corporal, examinamos la morfología de estas células mediante microscopía óptica y electrónica. En los mutantes NvSox2, las pequeñas células perforantes de la pared del cuerpo fueron reemplazadas por completo por un tipo de célula morfológicamente distinta (Fig. 3b). A nivel general, el tipo de célula mutante tenía la apariencia de un espirocito robusto (célula atrapante), un tipo de célula urticante que normalmente no se encuentra en N. vectensis pero es común en otras anémonas de mar (Datos de origen). Investigamos estas células mutantes en busca de evidencia de características celulares atrapantes mediante microscopía electrónica de barrido y transmisión (SEM y TEM, respectivamente). Las células punzantes de la pared del cuerpo de los pólipos de tipo salvaje tenían cápsulas rígidas con una pared de cápsula gruesa y aletas prominentes en el extremo apical (mirando hacia afuera) (Fig. 3c-e). Cuando se descargaron, estas células urticantes revelaron un túbulo extrusivo con grandes espinas proximalmente (el "arpón") y pequeñas púas distalmente (Fig. 3f). Estas características son diagnósticas de las células perforantes de la anémona de mar25,29,30. Por el contrario, la cápsula de las células mutantes extruidas parecía endeble, colapsando tras la descarga, y el aparato extrusivo consistía en un túbulo liso sin espinas ni púas (Fig. 3g). Las células mutantes también tienen una pared de cápsula delgada con una apariencia dentada a lo largo de la superficie interna y una tapa apical plana (Fig. 3h-j), características consistentes con células atrapantes, no perforantes17,31,32. Además, las secciones transversales del túbulo extrusivo internalizado en las células mutantes revelaron pequeñas varillas consistentes con la apariencia de células atrapantes no descargadas (Fig. 3k), aunque estas varillas eran más pequeñas y menos numerosas de lo que se ha descrito para las células atrapantes encontradas en animales de tipo salvaje17. Sin el etiquetado del linaje celular, no podemos descartar la posibilidad de que la desactivación de NvSox2 haya causado tanto la pérdida de células penetrantes como la ganancia de células atrapantes en dos linajes celulares distintos en la pared corporal de N. vectensis. Teniendo en cuenta que la pérdida de NvSox2 no afectó la cantidad de células urticantes que expresan Mcol4 en la pared del cuerpo, la explicación más simple de estos resultados es que la pérdida de NvSox2 provoca una transformación de pequeñas células perforantes en células atrapantes en la pared del cuerpo de N. vectensis.

se requieren NvSox2, PaxA y Mcol1 para el desarrollo de pequeñas células perforantes (azul) en la pared del cuerpo; ilustración modificada de: Babonis, LS, Ryan, JF, Enjolras, C. y Martindale, MQ El análisis genómico del triptoma revela los mecanismos moleculares de la evolución de las células glandulares. EvoDevo 10, 23 (2019)—CC BY 4.0. b Puntas de flecha azules: pequeñas células perforantes; puntas de flecha blancas: células mutantes. M: mesoglea, Ecto: ectodermo. Las celdas son de color falso. Las imágenes corresponden al área dentro del cuadro azul en a; N = 2 pólipos juveniles por tratamiento. c–k Micrografías electrónicas de células urticantes de la pared corporal de pólipos juveniles c–f de tipo salvaje y mutantes g–k (N = 2 individuos por tratamiento). c – e TEM de una pequeña celda de perforación. Los recuadros en c indican las regiones resaltadas en d y e. Los colgajos apicales son de color falso en d. Las puntas de flecha negras en e resaltan la gruesa pared de la cápsula. f SEM de una pequeña celda de perforación. Las estructuras relevantes son de color falso: amarillo—cápsula, verde—aletas apicales, magenta—arpón con espinas, azul—túbulo con púas. El recuadro en f muestra el detalle del túbulo. g SEM de una célula urticante mutante que carece de espinas y púas. TEM h-k de células urticantes mutantes. h Los recuadros indican las regiones resaltadas en i–k. Las imágenes de gran aumento muestran i capuchón apical (color naranja falso), j pared de la cápsula delgada y dentada (puntas de flecha hacia atrás) y k túbulo interiorizado con varillas laterales cortas (puntas de flecha blancas). l Morfometría de la cápsula (ancho frente a largo) en células atrapantes gráciles (grises) y robustas (negras) (extraídas de la literatura) y células mutantes (naranja) (ANCOVA, gráciles frente a robustas: p = 0,42032, gráciles frente a mutantes: p = 0,30121 ). N = número de células analizadas. m Ancho de la cápsula en células atrapantes gráciles, mutantes y robustas (ANOVA con post hoc de Bonferroni, grácil frente a mutante p = 5,2E-06; robusta frente a mutante p = 1,3E-11; grácil frente a robusta p = 2E-16). Promedios calculados a partir de los mismos datos presentados en el panel l. n Abundancia de células con el fenotipo mutante en pólipos de tipo salvaje y mutantes (Mann-Whitney U, p = 3.2E-5); N = 12 pólipos primarios por tratamiento. Para todos los diagramas de caja: mediana—línea media, percentiles 25 y 75—caja, percentiles 5 y 95—bigotes, valores atípicos—puntos individuales. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A pesar de tener las características morfológicas canónicas de las células atrapantes maduras, las células que se desarrollaron en la pared corporal de los mutantes NvSox2 eran morfológicamente distintas de las células atrapantes gráciles que se desarrollan en las puntas de los tentáculos de los animales de tipo salvaje, lo que nos lleva a plantear la hipótesis de que la pérdida de NvSox2 causó el desarrollo de células atrapantes robustas en la pared del cuerpo de N. vectensis. Las condiciones de "robustez" y "gracilidad" no están bien definidas; Para remediar esto, analizamos la longitud y el ancho de la cápsula de las células atrapantes no descargadas de la literatura que se informó que eran robustas o gráciles. La relación entre el ancho y la longitud de la cápsula no difirió para las células atrapantes robustas y gráciles en un rango de tamaños (Fig. 3l); sin embargo, para una longitud determinada, las células atrapantes robustas eran significativamente más anchas que las células gráciles (Fig. 3l, m). El ancho de la cápsula que se desarrolló en la pared del cuerpo de los mutantes NvSox2 es distinto e intermedio entre el ancho de la cápsula informado para las células atrapantes gráciles y robustas en la literatura (Fig. 3m). Sorprendentemente, el examen de animales de tipo salvaje reveló la presencia de células con esta morfología mutante, aunque con una frecuencia muy baja. Mientras que el tipo de célula mutante comprendía casi el 50 % de las células urticantes en los mutantes NvSox2, menos del 1 % de las células urticantes de los tipos salvajes tenían esta morfología (Fig. 3n). De los 12 pólipos de tipo salvaje examinados, sólo uno parecía carecer por completo de estas células mutantes. Estos resultados sugieren que los errores pueden surgir espontáneamente en la vía reguladora de NvSox2 a baja frecuencia, lo que da como resultado el desarrollo de células atrapantes robustas en animales de tipo salvaje. Debido a que las células atrapantes robustas son comunes y abundantes en otras anémonas de mar (Datos de origen), es razonable sugerir que este tipo de célula probablemente estuvo presente en el ancestro común más reciente de todas las anémonas de mar. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la desactivación de NvSox2 ha resultado en atavismo de una sola célula, o la restauración de un tipo de célula ancestral (célula atrapante robusta) en N. vectensis.

Para investigar más a fondo la identidad de las células atrapantes, examinamos la distribución y el desarrollo de las células atrapantes gráciles nativas y las células atrapantes mutantes en N. vectensis. Tanto en los animales de tipo salvaje como en los mutantes NvSox2, se encontraron espirocitos gráciles solo en las puntas de los tentáculos (Fig. 4a); por el contrario, las células perforantes pequeñas estaban presentes en las puntas de los tentáculos de los animales de tipo salvaje únicamente y las células atrapantes mutantes estaban presentes en los tentáculos de los animales mutantes NvSox2 únicamente. Estos resultados son consistentes con la transformación de pequeñas células penetrantes en células mutantes que se observan en la pared del cuerpo (Fig. 3), donde las células pequeñas penetrantes son el tipo celular predominante. Para determinar si las células atrapantes gráciles y mutantes son molecularmente distintas, examinamos la expresión de una proteína de unión a Ca2+ llamada Calumenina F (CaluF)33. En los animales de tipo salvaje, CaluF se expresa exclusivamente en los tentáculos, de acuerdo con la distribución de las células gráciles, y se coexpresa en las células marcadas con el anticuerpo anti-Mcol425, lo que confirma que se expresa en las células urticantes (Fig. 4b). Sin embargo, CaluF nunca se coexpresa con el gen específico de células perforantes, Mcol1 (Fig. 4B)25 y, por lo tanto, es un marcador positivo y específico de células atrapantes gráciles. La eliminación de NvSox2 no afectó el momento de aparición o la distribución de las células que expresan CaluF (Fig. 4c), lo que confirma que las células atrapantes mutantes no son células gráciles. Además, el análisis de la morfología de las células gráciles por TEM confirmó que las células gráciles de animales salvajes y mutantes son morfológicamente indistinguibles (Fig. 4d-i). A la luz de estos resultados, sugerimos que la desactivación de NvSox2 provoca una transformación homeótica de pequeñas células perforantes en células atrapantes robustas en cualquier lugar donde normalmente se especificarían pequeñas células perforantes. Por el contrario, la pérdida de NvSox2 no afectó el desarrollo de células atrapantes gráciles, lo que sugiere que las células atrapantes gráciles y robustas están modeladas utilizando mecanismos distintos.

a Las células atrapantes gráciles (magenta de color falso) están presentes en las puntas de los tentáculos de los animales de tipo salvaje (N = 5) y mutantes NvSox2 (N = 4); las células perforantes pequeñas (azul) están solo en los tipos salvajes y las células atrapantes robustas (naranja) están solo en los mutantes. Los colores corresponden a la Fig. 2b. Polo oral a la izquierda en a–c. b CalumeninF (CaluF) es un marcador específico de células atrapantes gráciles. Mcol4 (cian) y Mcol1 (magenta) se expresan conjuntamente en los tentáculos y la pared del cuerpo (punta de flecha negra; recuadro) (N = 6 animales). CaluF (amarillo) se expresa solo en los tentáculos. Recuadros: CaluF se coexpresa con Mcol4 (puntas de flecha blancas) pero nunca con Mcol1 (magenta). c La eliminación de NvSox2 no afectó el inicio de la expresión de CaluF ni la distribución de las células que expresan CaluF. Todas las barras de escala en c: 50 um. Cada panel es representativo de al menos 10 personas en cada etapa. TEM d-i de células atrapantes gráciles de pólipos juveniles de tipo salvaje (N = 3) y mutantes (N = 2). La eliminación de NvSox2 no afectó la morfología de la pared de la cápsula dentada (puntas de flecha blancas) o las varillas laterales en el túbulo internalizado (puntas de flecha negras). Las imágenes fluorescentes se ajustaron en contraste y brillo usando Fiji.

En N. vectensis, el epitelio de la punta del tentáculo de tipo salvaje está poblado por células perforantes pequeñas (raras), células perforantes grandes (abundantes) y células atrapantes gráciles (abundantes) (Fig. 2b)25,26,28. El examen de las puntas de los tentáculos mediante microscopía óptica confirmó que las pequeñas células perforantes se transformaron por completo en robustas células atrapantes, lo que refleja los efectos en la pared del cuerpo, pero las células perforantes grandes están presentes tanto en animales salvajes como mutantes (Fig. 5a). Las células perforantes grandes inicialmente aparecieron imperturbables por la pérdida de NvSox2 ya que no hubo cambios detectables en la distribución de estas células o la expresión de PaxA o Mcol1 en las puntas de los tentáculos (Fig. 2i, k); sin embargo, al usar una tiramida conjugada con H2O2 para marcar los arpones de las células perforantes, mostramos que los animales mutantes exhiben una morfología de arpón aberrante (Fig. 5b). Específicamente, la porción proximal del arpón apareció en forma de bucle en las células perforantes grandes de los animales mutantes, en comparación con el arpón recto que se encuentra en los pólipos de tipo salvaje. Para evaluar los cambios en la abundancia de células perforantes en la punta del tentáculo, contamos la cantidad de arpones marcados en relación con la cantidad total de núcleos y mostramos una pérdida significativa (~ 20%) de células perforantes en animales mutantes (Fig. 5c). Este resultado es consistente con la transformación de las células perforantes pequeñas en las puntas de los tentáculos en células atrapantes robustas (Fig. 5a) y sugiere que las células perforantes pequeñas comprenden ~ 20% de las células perforantes en la punta del tentáculo de los animales de tipo salvaje. Para investigar más a fondo su morfología de arpón aberrante, inducimos la descarga de células perforantes de la punta del tentáculo en pólipos de tipo salvaje y mutantes utilizando un sistema de ablación láser infrarrojo (XY Clone, Hamilton Thorne, EE. UU.) (Películas complementarias 1, 2). El examen de las células perforantes descargadas sugirió que el fenotipo en bucle de los mutantes se debe al alargamiento del arpón (Fig. 5d, e). Para cuantificar este efecto, medimos la longitud del arpón y la longitud de la cápsula en las células urticantes descargadas de las puntas de los tentáculos de los pólipos de tipo salvaje y mutantes y mostramos un aumento significativo (~50 %) en la longitud del arpón en mutantes. animales (Fig. 5f).

a Células perforantes grandes (falso color amarillo) están presentes en las puntas de los tentáculos de animales de tipo salvaje (N = 5) y mutantes NvSox2 (N = 4); También se indican pequeñas células perforantes (azul) y espirocitos robustos (naranja). Los colores corresponden a la Fig. 2b. b Los arpones (magenta) de células perforantes grandes en mutantes NvSox2 tienen una morfología aberrante (en bucle). Núcleos: blanco (DAPI). c La abundancia de células perforantes es significativamente menor en las puntas de los tentáculos de los mutantes NvSox2 que en los tipos salvajes (Mann-Whitney U, p = 1.6E-4). N = 11 pólipos primarios por tratamiento. d Imágenes fijas de videos de descarga de células punzantes inducidas por láser (Películas complementarias S1 y S2). Las puntas de flecha blancas indican la transición del arpón al túbulo. El área con un círculo rojo muestra el objetivo del láser (movido después de la descarga). e Células perforantes grandes después de una descarga inducida; la cápsula, el arpón y el túbulo tienen un color falso. Los túbulos no se descargaron por completo y parecen cortos en los mutantes. f Los arpones son significativamente más largos en células perforantes grandes de animales mutantes que en los tipos salvajes (Mann-Whitney U, p = 2.1E-13). Número de células analizadas: N = 57 (tipo salvaje), N = 41 (mutante). g La morfología de arpón en bucle (punta de flecha blanca) está presente en los mastigoforos macrobásicos de la anémona de mar Cylista elegans (N = 2 individuos); también se muestra un mastigoforo microbásico de la misma especie. h La morfología de los mastigoforos microbásicos (células perforantes) en los mesenterios de N. vectensis no se vio afectada por la desactivación de NvSox2 (N = 6 animales cada uno). Los arpones (puntas de flecha blancas) están etiquetados como en b. i Diagrama del papel de NvSox2 en la conducción de la morfogénesis de arpón en células perforantes grandes. La eliminación de NvSox2 no afecta la expresión de PaxA o Mcol1 en este linaje celular, pero aumenta la longitud del arpón (caja magenta). Los arpones alargados deben enrollarse para que quepan dentro de la cápsula. Para todos los diagramas de caja: mediana—línea media, percentiles 25 y 75—caja, percentiles 5 y 95—bigotes, valores atípicos—puntos individuales. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Las imágenes fluorescentes se ajustaron en contraste y brillo usando Fiji.

El arpón en bucle de las células perforantes grandes en las puntas de los tentáculos de los mutantes NvSox2 fenocopia la apariencia en bucle del arpón en un tipo de célula perforante que se encuentra en otras especies de anémona de mar: el mastigoforo macrobásico34. En las células perforantes macrobásicas, el arpón es más largo que la cápsula en la que está contenido, por lo que el arpón debe enrollarse para encajar dentro de la cápsula; esta condición se demuestra con un mastigoforo macrobásico de la anémona de mar Cylista elegans (Fig. 5g). Por el contrario, las células microbásicas desarrollan un arpón que es más corto que la longitud de la cápsula, por lo que el arpón encaja completamente dentro de la cápsula sin formar bucles. En N. vectensis, todos los mastigophores son microbásicos y se encuentran solo en el epitelio ectodérmico del tracto digestivo (Fig. 2b). La eliminación de NvSox2 no afectó el tamaño de los arpones de mastigophore en N. vectensis ya que todos los mastigophores retuvieron la morfología microbásica tanto en animales de tipo salvaje como mutantes (Fig. 5h). Si bien el papel de NvSox2 en la conducción del alargamiento del arpón parece estar restringido a las células perforantes grandes (isorhizas basítricas) en N. vectensis, este control de un solo gen del desarrollo del arpón (Fig. 5I) proporciona un mecanismo por el cual el macrobásico la condición de arpón podría haber evolucionado numerosas veces, de forma independiente, en otros tipos de células urticantes35.

Los genes Sox son ubicuos entre los genomas animales y se agrupan en 8 grupos principales (SoxA-SoxH)19, al menos cuatro de los cuales probablemente estaban presentes en el ancestro común de cnidarios y vertebrados (SoxB, SoxC, SoxE, SoxF). Los análisis filogenéticos previos de los genes Sox de N. vectensis han sugerido que NvSox2 es un ortólogo20 específico de cnidario o un miembro del clado SoxB24,36,37. Para probar aún más estas hipótesis, construimos una filogenia de máxima probabilidad de genes Sox de 15 cnidarios y 6 bilaterianos (Figura complementaria 5; Datos complementarios 1). Con este extenso muestreo de taxones, encontramos un fuerte apoyo para la monofilia de un clado que incluye ortólogos NvSox2 de corales y anémonas de mar, pero un apoyo débil que vincula el clado NvSox2 con cualquier gen Sox bilateral conocido. Además, no encontramos evidencia de un ortólogo de NvSox2 en medusozoos, octocorales o cerianthids (anémonas de tubo), lo que sugiere que NvSox2 surgió en el ancestro del tallo de los corales y las anémonas de mar (hexacorals no cerianthid), después del origen de las células atrapantes (espirocitos). ) (Fig. 1m).

Aunque se ha asumido que las células perforantes pequeñas y grandes son dos clases de tamaño del mismo tipo de célula25, mostramos que en realidad son dos tipos molecularmente distintos de células punzantes. En ausencia de NvSox2, las pequeñas células perforantes adquirieron una nueva identidad (atrapadora) (Fig. 6a), pero la pérdida de NvSox2 fue insuficiente para cambiar la identidad celular en las células perforantes grandes. Por lo tanto, se requiere NvSox2 para el desarrollo de un conjunto de rasgos asociados con el fenotipo perforante en células perforantes pequeñas (p. ej., espinas basales y una cápsula gruesa con aletas apicales) (Fig. 3) y solo un rasgo (longitud de arpón) en células grandes. células perforantes (Fig. 5). Evolutivamente, la integración de NvSox2 en el linaje de células atrapantes robustas parece haber permitido el origen paralelo del fenotipo de células perforantes (Fig. 6b). Críticamente, esto sugiere que las células penetrantes ("nematocitos") y las células atrapantes ("espirocitos") no son tan distintas filogenéticamente como se pensaba, sino que representan dos destinos alternativos de células urticantes controlados por un solo gen.

se requiere un NvSox2 para la especificación de células perforantes pequeñas (nematocitos, azul); las células atrapantes (espirocitos, magenta) se especifican en ausencia de NvSox2. b Un escenario para la cooptación evolutiva de una célula trampa ancestral con una cápsula y un túbulo eversible para generar una célula perforante con una pared de cápsula gruesa, aletas apicales, un arpón espinoso y un túbulo. c Las anémonas de mar del género Edwardsiella ilustran los posibles roles de NvSox2 en la conducción de transiciones entre células perforantes y células atrapantes durante la adaptación a diferentes hábitats. E. ignota y E. andrillae son taxones hermanos; E. ignota excava en la arena/lodo y tiene células perforantes en la pared de su cuerpo y E. andrillae excava en el hielo marino y tiene células atrapantes en la pared de su cuerpo. E. lineata y E. carnea cambian entre un estado de vida libre (enterrado en arena/barro) y un estado parasitario que carece de tentáculos; este cambio se refleja en una transición entre los tipos de células urticantes. Ilustraciones de anémonas de mar modificadas de: Babonis, LS & Martindale, MQ Se requiere PaxA, pero no PaxC, para el desarrollo de cnidocitos en la anémona de mar Nematostella vectensis. EvoDevo 8, 14 (2017) —CC BY 4.0. d La homeosis de un solo gen proporciona una explicación mecánica para la variación amplia y discontinua en los tipos de células urticantes observadas en la pared del cuerpo de cnidarios estrechamente relacionados de diferentes hábitats. Las células atrapantes (caja magenta) se encuentran en los corales duros, las anémonas de mar y las anémonas de tubo y probablemente surgieron en el último ancestro común de este clado. Las anémonas de tubo carecen de un ortólogo de NvSox2, lo que sugiere que este gen surgió en el ancestro del tallo de los corales duros y las anémonas de mar. La incorporación de NvSox2 a la red reguladora de genes que impulsa el desarrollo ancestral de células atrapantes en la pared corporal de algunas anémonas de mar (p. ej., N. vectensis y E. ignota) explica por qué estos taxones ahora tienen células perforantes (basítricos; caja azul) en la pared corporal. mientras que sus parientes cercanos (p. ej., N. vectensis mutante y E. andrillae, respectivamente) tienen células atrapantes en su lugar. El control de un solo gen de la identidad celular podría impulsar de manera similar las transiciones homeóticas en la diversidad punzante en todo este clado. Tipo salvaje WT.

La transformación homeótica de la identidad celular explica cómo el complemento de las células urticantes que se encuentran en dos cnidarios estrechamente relacionados pueden diferir de manera bastante dramática. Las anémonas marinas excavadoras se encuentran en una amplia variedad de hábitats y proporcionan una valiosa ilustración de este fenómeno (Fig. 6c). Mientras que algunas especies se encuentran en un hábitat arenoso (como Nematostella vectensis y Edwardsiella ignota), otras excavan en el hielo marino (como Edwardsiella andrillae)38. Una transición evolutiva de las robustas células atrapantes que se encuentran en la pared del cuerpo de E. andrillae a las pequeñas células perforantes que se encuentran en la pared del cuerpo de E. ignota podría explicarse mediante la incorporación del ortólogo NvSox2 en la red reguladora de genes que impulsa el desarrollo del cuerpo. células urticantes de la pared en E. ignota pero no en E. andrillae. Asimismo, las especies hermanas E. lineata y E. carnea experimentan una transición ecológica durante su vida desde un estado de vida libre (madrigueras en arena/barro) a un estado parasitario (madrigueras en el tracto digestivo de un ctenóforo);39 esto La transición va acompañada de una transformación de los tipos de células urticantes en la pared del cuerpo en estas dos etapas diferentes de la vida. Las células perforantes se encuentran en la pared del cuerpo de individuos de vida libre; Si bien se ha debatido la identidad específica de las células urticantes en la pared corporal de estos animales durante su etapa parasitaria40,41, son muy similares en morfología a las células atrapantes robustas identificadas en nuestros mutantes NvSox2. Esto sugiere que un evento homeótico unicelular similar puede regular el cambio en la identidad de las células urticantes asociado con los hábitats variables utilizados por cada etapa de la vida. Este escenario también podría explicar las numerosas transiciones entre los distintos tipos de células urticantes que se encuentran en la pared del cuerpo de otras anémonas marinas excavadoras que invaden hábitats únicos, proporcionando una explicación para la variación discontinua en los tipos de células urticantes que se encuentran entre especies estrechamente relacionadas en Cnidaria (Fig. 6d )40,41.

Hemos demostrado que la desactivación de un solo factor de transcripción (NvSox2) hizo que las células penetrantes adquirieran la morfología (Fig. 3) y la firma molecular (Figs. 2 y 4) de las células atrapantes y que estas células mutantes conservan la capacidad de descarga. Juntos, estos resultados confirman que esta mutación es funcionalmente relevante y es, por lo tanto, una transformación homeótica bona fide7. Es importante destacar que la transformación resultó en la restauración de un tipo de célula atrapante que se había perdido en el ancestro del linaje que dio lugar a Nematostella vectensis. Así, hemos mostrado un caso especial de homeosis: el atavismo unicelular, o la restauración de un tipo celular ancestral en una especie moderna. Como esta es la primera evidencia de atavismo en un cnidario, nuestros resultados sugieren que el control homeótico del destino celular es un mecanismo antiguo que ha contribuido a la expansión de la biodiversidad desde el último ancestro común de cnidarios y bilaterales, hace más de 800 millones de años42.

Nuestra capacidad para resucitar un tipo de célula ancestral mediante la manipulación de un solo gen demuestra cómo la homeosis vincula la flexibilidad del desarrollo con las presiones de selección ambiental para impulsar la aparición de nuevos tipos de células. Específicamente, la capacidad de silenciar las propiedades funcionales de los tipos de células ancestrales mientras se conservan las instrucciones para su especificación permite a los animales una flexibilidad extrema mientras exploran nuevos hábitats. Como apoyo adicional a esta idea, se encontró que un solo gen regulador controla un cambio homeótico en el patrón de color del ala de la mariposa, proporcionando un mecanismo por el cual puede ocurrir una evolución morfológica rápida cuando un fenotipo multicelular está controlado por un solo cambio genético43. Estos ejemplos demuestran cómo la capacidad de seleccionar entre múltiples identidades celulares posibles con un solo gen puede crear oportunidades eficientes para la adaptación a las condiciones locales. La capacidad de redistribuir tipos de células silenciadas puede, por lo tanto, ser un mecanismo macroevolutivo generalizado, pero poco apreciado, para generar diversidad de tipos de células en animales.

La observación de que NvSox2 controla la morfogénesis del arpón, no la especificación, en células perforantes grandes recapitula la variación fenotípica observada en otro linaje de células punzantes (mastigoforos; Fig. 5). El hecho de que NvSox2 controle solo la longitud del arpón en células perforantes grandes sugiere que debería ser posible encontrar genes individuales que controlen de manera similar la morfología de las espinas, el número de púas, la composición de la pared de la cápsula y la forma de la estructuras apicales. De hecho, un estudio reciente de la función de las células perforantes en N. vectensis identificó una proteína similar a la espinalina44 como un componente específico del arpón45. Los estudios futuros que investiguen las relaciones reguladoras de los factores de transcripción, como NvSox2, y los genes efectores que impulsan la morfología del arpón, incluido el tipo de la espinalina, en una sola célula brindarán una oportunidad única para reconstruir la diversificación evolutiva de cada tipo de célula urticante individual y conducir a una comprensión más profunda de cómo evolucionan las redes reguladoras de genes. Similar al control modular de la identidad neuronal descrito a partir de nematodos46, este marco explica cómo la evolución podría mezclar y combinar genes que controlan aspectos finos del fenotipo subcelular para producir la diversa gama de tipos de células que impulsan la biodiversidad animal y proporciona un modelo para caracterizar la evolución. de otros orgánulos novedosos.

El locus NvSox2 se eliminó mediante una modificación de dos protocolos CRISPR/Cas9 publicados47,48. En resumen, se diseñaron cinco ARN guía para apuntar a diferentes sitios en el locus NvSox2, cuatro en la secuencia de codificación y uno en 5 'UTR (Figura 1 complementaria, Tabla 1). Los ARN guía se adquirieron de Synthego (EE. UU.) y se reconstituyeron a 30 uM en agua libre de nucleasas (Synthego) siguiendo las instrucciones del fabricante. La proteína Cas9 (PNABio CP01-50) se reconstituyó a 1 mg/ml en agua libre de nucleasas (Ambion AM9937) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ARN guía se mezclaron con Cas9 en una proporción de 5:4 (vol:vol) gRNA:Cas9, se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min y se inyectaron en cigotos con 0,2 mg/ml de dextrano libre de ARNasa Alexa-555 (Invitrogen D34679) y agua libre de nucleasas (Ambion). Para determinar si hubo efectos no específicos de los ARN guía o Cas9, se inyectaron embriones de control con ARN guía pero sin proteína Cas9 o con proteína Cas9 sola. Estos animales se desarrollaron normalmente y no se examinaron más. Los embriones mutantes Mosaic F0 NvSox2 se criaron hasta la madurez reproductiva a 16 C y se generaron para generar la generación F1. El ADN genómico se extrajo de las puntas de los tentáculos de los pólipos F1 y se secuenció para detectar mutaciones. Se identificó que una hembra F1 y un macho F1 tenían deleciones significativas en el locus NvSox2 (Fig. 1 complementaria) y se usaron para producir la generación F2. Todos los demás análisis de células/tejidos se realizaron en la generación F2.

Para evaluar los efectos de la desactivación de NvSox2 en el desarrollo de células urticantes, las células urticantes inmaduras se marcaron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo dirigido contra minicolágeno-4 (α-Mcol4)25,26 diluido 1/1000 en suero de cabra normal (Sigma G9023) ( Fig. 4 complementaria) y células urticantes maduras (células perforantes solamente) se marcaron durante 30 minutos a 25 °C en DAPI de alta concentración (143 uM en PBS con Tween al 0,1 % y EDTA 10 mM)25,26,49. La expresión embrionaria de NvSox2, PaxA, Mcol1 y CaluF se examinó mediante hibridación in situ (ISH) siguiendo los protocolos establecidos50,51. Para lograr ISH fluorescente de dos colores, las muestras se incubaron simultáneamente en sondas de ARNm marcadas con digoxigenina y fluoresceína durante la noche a 63 C. Luego, las sondas se detectaron secuencialmente usando anticuerpos anti-DIG/POD y anti-FL/POD (Roche 11207733910, 11426346910 ) y tiramida acoplada con fluoresceína o Cy3.

Los animales en desarrollo se fijaron para su examen en la etapa de brote de tentáculo (240 h después de la fertilización a 16 C). Para co-localizar el ARNm de Mcol1 y la proteína Mcol4, realizamos ISH fluorescente seguido de inmunohistoquímica en los mismos tejidos26. Luego, los tejidos marcados se montaron en glicerol en portaobjetos de vidrio, se tomaron imágenes con un microscopio confocal Zeiss 710 y las pilas z se convirtieron en imágenes 3D utilizando el software Imaris v 7.6.1 (Oxford Instruments, EE. UU.). Las regiones de interés se demarcaron utilizando la herramienta de cultivo en Imaris y las células marcadas se contaron a simple vista en una región cuadrada de interés de 100 × 100 um alrededor de los brotes de tentáculos. Comparamos el número de células marcadas con α-Mcol4 en mutantes de tipo salvaje y NvSox2 utilizando una prueba U de Mann-Whitney de 2 caras y no encontramos diferencias significativas en el número total de células marcadas con α-Mcol4 (p = 0.623176). Luego contamos el número de células en la misma región de interés que coexpresaron Mcol1 y Mcol4 y encontramos una disminución significativa en los mutantes NvSox2, en relación con los animales de tipo salvaje (p = 1.57E-4). Los datos se presentan (Fig. 2l) como porcentaje de células marcadas con el anticuerpo α-Mcol4 que también se marcaron con la sonda de ARNm de Mcol1. En cada tratamiento se examinaron N = 10 animales en etapa de brote de tentáculo.

Para determinar si NvSox2 formaba parte de la red reguladora de genes de células urticantes, derribamos SoxB2 y PaxA utilizando morfolinos (GeneTools, LLC) que se validaron previamente22,26 (secuencias proporcionadas en la Tabla 1). Los morfolinos se reconstituyeron a 1 mM en agua libre de nucleasas (Ambion) y se almacenaron en la oscuridad hasta el día de su uso, siguiendo las instrucciones del fabricante. El día de la inyección, los morfolinos (MO) se calentaron a 65 C durante 10 min, se centrifugaron a 25 C durante 1 min y se diluyeron a 0,9 mM en agua libre de nucleasas con dextrano fluorescente hasta una concentración final de 0,2 mg/ml. Para el análisis de qPCR, se compararon tres réplicas de cada condición (tipo salvaje/no inyectado, control MO, SoxB2 MO y PaxA MO) que representaban tres inyecciones independientes realizadas en días diferentes usando el método delta-delta CT y el paquete de PCR en el estadístico R. entorno informático52,53. Los valores de expresión para el análisis de qPCR se presentan como cambio de pliegue, en relación con la expresión del factor de elongación del gen de limpieza 1β (EF1β) normalizado a 1,0 en embriones no inyectados y la significación estadística se calculó a partir de la comparación de embriones inyectados con SoxB2 MO y PaxA MO para controlar los embriones inyectados con MO.

El tamaño y la abundancia de las células mutantes se midieron en pólipos primarios disociados (etapa de 4 tentáculos) mediante preparación de calabaza en N = 12 pólipos por condición (tipo salvaje y mutante NvSox2). Cada pólipo se inmovilizó en MgCl2 al 7,14 %, se fijó en paraformaldehído al 4 % en PBS con Tween al 0,1 % (PTw) durante 2 h a 4 °C, se lavó extensamente en PTw y se montó individualmente en un volumen mínimo de glicerol en un portaobjetos de vidrio. Se bajó un cubreobjetos de vidrio sobre el tejido fijado y se aplastó/untó para disociar el pólipo fijado. Los recuentos de células mutantes se presentan como el número de células mutantes en relación con el número de células perforantes contadas al mismo tiempo en tres transectos visuales no superpuestos a través del tejido disociado. Los tamaños de las celdas se evaluaron en imágenes no superpuestas capturadas a lo largo de estos transectos utilizando la herramienta Medir en Fiji v 1.53 f (ImageJ)9.

Para este estudio se desarrolló un método para marcar arpones (la porción espinosa basal de los túbulos eversibles en las células perforantes) utilizando tiramida acoplada con Cy3. Los pólipos primarios se fijaron durante 1 minuto a 25 °C en paraformaldehído al 4 % en PTw con glutaraldehído al 0,2 % y durante 1 hora a 4 °C en paraformaldehído al 4 % en PTw. Los tejidos fijados se lavaron dos veces en agua libre de nucleasas para eliminar el PTw y se almacenaron en metanol al 100 % a -20 °C hasta su uso. Para la tinción, los tejidos se rehidrataron lentamente de metanol a PTw y luego se lavaron tres veces (20 min cada una) en PTx (PBS con Triton al 0,2 %) y tres veces (20 min cada una) en H2O2 al 3 % a 25 C. Luego se lavaron los tejidos tres veces (10 min cada una) en PTw para eliminar el exceso de H2O2 y se incubaron en 0,2 % de tiramida-Cy3 (con 0,001 % de H2O2) durante 45 min en la oscuridad. El exceso de tiramida y H2O2 se eliminó con tres lavados en PTw y los pólipos se contrastaron con DAPI 1 uM durante 30 minutos antes de montarlos en portaobjetos de vidrio en glicerol y comprimirlos ligeramente bajo un cubreobjetos estabilizado con pies de arcilla. La obtención de imágenes se realizó el mismo día que el etiquetado en un confocal Zeiss 710. Las pilas Z se renderizaron en imágenes 3D con Imaris y las regiones de interés se demarcaron con la herramienta Recortar. Los arpones etiquetados de N = 11 pólipos por condición (de tipo salvaje o mutante) se contaron a simple vista y los núcleos se contaron automáticamente con la herramienta Puntos. El tamaño del arpón y el tamaño de la cápsula se midieron en imágenes no superpuestas de las puntas de los tentáculos capturadas después de la descarga inducida por láser de las células urticantes utilizando la herramienta Medir en Fiji54.

Para inducir la descarga de células urticantes, los pólipos juveniles (etapa de 6 tentáculos) se inmovilizaron durante 5 minutos en MgCl2 al 7,14 % y se montaron en portaobjetos de vidrio y se comprimieron ligeramente bajo cubreobjetos estabilizados con pies de arcilla. Se usó un sistema de ablación láser infrarrojo (XY Clone, Hamilton Thorne) montado en el objetivo 20X de un axioscopio Zeiss para inducir la descarga de las células urticantes de la punta del tentáculo con una potencia del 100% y un pulso de 500us.

Antes de iniciar cualquier análisis, los experimentos fueron planificados y descritos en un Phylotocol55. Las modificaciones posteriores a los análisis se anotaron y justificaron en ese documento. Muchos genes, además de los genes Sox, incluyen una caja HMG, por lo que la búsqueda de genes Sox utilizando solo el modelo HMG de Markov oculto (HMM) produjo muchas secuencias no diana. Para identificar específicamente los genes Sox, generamos un HMG HMM personalizado a partir de una alineación de genes Sox publicada56 después de eliminar las secuencias del grupo externo (Tcf/Lef y Capicua/CIC) usando hmmbuild (hmmer.org). Luego usamos este HMM personalizado para buscar genes Sox en transcriptomas traducidos de 15 cnidarios y seis bilaterales. Las abreviaturas para los taxones de cnidarios que usamos son las siguientes: Aala —Alatina alata, Adig—Acropora digitifera, Amil—Acropora millepora, Epal—Exaiptasia pallida, Avan—Atolla vanhoeffeni, Ccrux—Calvadosia cruxmelitensis, Came—Ceriantheopsis americana, Chem—Clytia hemisphaerica, Cxam—Cassiopea xamachana, Elin—Edwardsiella lineata, Hech—Hydractinia echinata, Hmag—Hydra magnipapillata, Hsan—Haliclystus sanjuanensis, Nvec—Nematostella vectensis, Rren—Renilla reniformis; y para los bilaterales: Bflo—Branchiostoma floridae, Cint—Ciona intestinalis, Cele—Caenorhabditis elegans, Dmel—Drosophila melanogaster, Hsap—Homo sapiens, Lgig—Lottia gigantea, Spur—Strongylocentrotus purpuratus. Utilizamos este HMM personalizado en combinación con nuestro script hmm2aln (https://github.com/josephryan57) para generar una alineación que incluía las secuencias originales utilizadas para generar el HMM. Luego eliminamos todas las secuencias de ctenóforos, esponjas y placozoos de esta alineación y generamos árboles.

El análisis filogenético se realizó siguiendo un protocolo publicado58. Brevemente, utilizamos la función de búsqueda de modelos con IQ-TREE para identificar el mejor modelo de sustitución para la alineación (proporcionado como Datos complementarios 1). Luego realizamos tres análisis de máxima verosimilitud, en paralelo, utilizando: RAxML con 25 árboles iniciales de parsimonia máxima, RAxML con 25 árboles iniciales aleatorios y una ejecución predeterminada con IQ-TREE. Luego comparamos los valores de máxima verosimilitud de los resultados de los tres análisis para seleccionar el mejor árbol y realizamos 1000 arranques rápidos usando RAxML para soporte de sucursales. El archivo de árbol final se modificó en FigTree v1.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) y Adobe Illustrator v 24.1.1 para la presentación.

Las comparaciones por pares de datos de conteo (Fig. 2j, l, Fig. 3n y Fig. 5c, f) se analizaron con una prueba U de Mann-Whitney de dos caras en Microsoft Excel v 2122. Los análisis morfométricos del tamaño de celda atrapado (Fig. .3l–n) se realizaron usando ANCOVA o ANOVA con un análisis post hoc de Bonferroni y los datos de qPCR se analizaron usando el método delta-delta CT y el paquete de PCR en R (v 4.2.1)52,53. Las micrografías electrónicas de células urticantes maduras de animales de tipo salvaje (Fig. 1, Fig. 3c-f) son imágenes representativas de al menos tres células del tipo indicado (nematocito, espirocito o pticocito) muestreadas de al menos dos individuos. Las micrografías electrónicas de los mutantes NvSox2 (Fig. 3g-k) son imágenes representativas de al menos dos células de dos individuos. Números exactos de células fotografiadas de cada individuo: Fig. 3g (N = 6,15), Fig. 3h (N = 12,15), Fig. 3i (N = 2,2), Fig. 3j (N = 5, 7), Fig. 3k (N = 4,5), Fig. 4g (N = 9,10), Fig. 4h (N = 5,7), Fig. 4i (N = 7,8).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio, incluidos los datos de origen, se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria). Los animales transgénicos se pondrán a disposición previa solicitud al autor correspondiente, a la espera de la finalización de un Acuerdo de transferencia de materiales. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Usamos un script personalizado (hmm2aln) para alinear los HMM para el análisis filogenético. Este script está disponible en: https://github.com/josephryan57.

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La microscopía electrónica se realizó en la Instalación de Microscopía Electrónica Biológica (BEMF) en la Universidad de Hawai'i, Manoa, y en el Centro de Microscopía y Análisis Electrónico (CEMAS), la Instalación de Microscopía e Imagen del Campus (CMIF) y la OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR) en la Universidad Estatal de Ohio (OSU). Agradecemos a Jeffrey Tonniges por su ayuda con la preparación de muestras para TEM en OSU. Financiamiento: este trabajo fue apoyado por fondos de la Administración Nacional de Aeronáutica y del Espacio a MQM (#NNX14AG70G), la Fundación Nacional de Ciencias a JFR (#1542597) y fondos de investigación institucional de OSU y la Universidad de Cornell a MD y LSB, respectivamente.

Laboratorio Whitney de Biociencia Marina, Universidad de Florida, St. Augustine, FL, EE. UU.

Leslie S. Babonis, Camille Enjolras, Brent M. Foster, Fredrik Hugosson, Joseph F. Ryan y Mark Q. Martindale

Departamento de Ecología y Biología Evolutiva, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, EE. UU.

Leslie S. Babonis

Laboratorio Nacional de Sistemática, Oficina de Ciencia y Tecnología, NOAA Fisheries, Washington DC, EE. UU.

Abigail J. Reft

Departamento de Zoología de Invertebrados, Museo Nacional Smithsonian de Historia Natural, Washington DC, EE. UU.

Abigail J. Reft

Departamento de Biología, Universidad de Florida, Gainesville, FL, EE. UU.

Joseph F. Ryan y Mark Q. Martindale

Departamento de Evolución, Ecología y Biología de Organismos, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

María Megan Daly

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LSB, CE, BMF, FH y MQM realizaron procedimientos de laboratorio, incluido el desarrollo de reactivos CRISPR, microinyección, ISH, clonación y análisis de secuencias y microscopía confocal. LSB, AJR y MD realizaron microscopía electrónica y analizaron fenotipos de células mutantes. LSB y JFR realizaron análisis filogenéticos. LSB concibió el estudio y escribió el manuscrito. Todos los autores editaron el manuscrito y aprobaron el borrador final.

Correspondencia a Leslie S. Babonis.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Babonis, LS, Enjolras, C., Reft, AJ et al. El atavismo unicelular revela un antiguo mecanismo de diversificación de tipos de células en una anémona de mar. Nat Comun 14, 885 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36615-9

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Recibido: 28 febrero 2022

Aceptado: 09 febrero 2023

Publicado: 16 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36615-9

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